結核分枝桿菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

朱琳 徐穎 孔聰 粟海波 黃琪 朱勝玲 王洪海

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結核分枝桿菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

朱琳 徐穎 孔聰 粟海波 黃琪 朱勝玲 王洪海

目的 用結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)特異性抗原Rv3400 聯合弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)構建結核亞單位疫苗(Rv3400-IFA)，在 C57BL/6小鼠體內評估其免疫效應。體外用抗原Rv3400感染巨噬細胞RAW264.7并評估其免疫應答。方法 PCR擴增基因Rv3400，構建重組質粒pET28a(+)-Rv3400，轉入大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS感受態細胞中，誘導表達并純化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、陽性對照脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，分別刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7，陰性對照為未刺激的巨噬細胞，流式細胞術檢測細胞表面分子表達，收集細胞培養上清，ELISA 檢測細胞因子的分泌。另一方面純化的Rv3400蛋白與IFA充分乳化構建亞單位疫苗免疫小鼠；C57BL/6小鼠采用數字表法隨機分為3組，分別為實驗組Rv3400組、陽性對照組Rv3425組、 陰性對照組IFA組，每組5只，每2周1次、共免疫3次。分別采用酶聯免疫斑點檢測技術(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和酶聯免疫吸附測定(ELISA) 技術對免疫小鼠的細胞免疫和體液免疫進行評估。結果 (1)成功克隆表達并純化結核分枝桿菌特異性抗原Rv3400。(2)體外細胞實驗結果顯示：Rv3400抗原刺激巨噬細胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達量顯著提高，陽性細胞比率[分別由未刺激的(34.70±2.40)%、(31.25±18.31)%、(41.80±6.01)%、(44.30±0.44)%提高至1 μg/ml Rv3400抗原刺激后的(90.45±7.71)%、(90.10±4.10)%、(89.97±7.79)%、(85.13±5.12)%]；能促進細胞分泌高水平的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，分別達(49 217.0±390.61)pg/ml、(1783.4±51.18) pg/ml。(3)免疫小鼠后，ELISPOT結果顯示：實驗組Rv3400組小鼠分泌INF-γ的斑點形成細胞(spot forming cells,SFC)(136.20±95.09)顯著高于陰性對照組(14.00±9.62)(t=2.859，P<0.01)；ELISA結果顯示: Rv3400組小鼠T細胞產生TNF-α和IFN-γ的水平[(247.38±142.268)pg/ml、(325.45±75.19)pg/ml)]明顯高于陰性對照組[(69.25±60.06)pg/ml、(2.22±1.28)pg/ml(t=2.579，P<0.05；t=8.597，P<0.01)]；(4)Rv3400 組小鼠脾CD4+CD44high、CD4+CD62Llow、CD8+CD44high、CD8+CD62LlowT淋巴細胞百分比[(44.20±11.95)%，(43.56±11.90)%，(48.88±7.42)%，(47.04±7.72)%]與對照組IFA組[(27.02±6.56)%，(62.60±4.73)%， (30.57±6.00)%，(58.48±6.06)%]相比，差異有統計學意義(one-way ANOVA，F=18.460，F=8.108，F=32.194；F=4.080；P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，呈顯著性增加。(5)通過間接ELISA測定免疫后的小鼠血清抗體IgG效價水平高達1∶409 600，表明抗原Rv3400也能誘導有效的體液免疫應答；IgG2b/IgG1水平為1.8，說明抗原Rv3400誘導小鼠以Th1型免疫反應為主。結論 亞單位疫苗Rv3400-IFA 在C57BL/6 小鼠體內可產生較好的細胞免疫和體液免疫效應。結核分枝桿菌特異性抗原Rv3400有望成為新的結核病疫苗設計及診斷的候選抗原。

分枝桿菌，結核； Rv3400； 亞單位疫苗； 細胞免疫； 體液免疫

結核病(TB)是由結核分枝桿菌感染引起的重大傳染病，是世界上僅次于艾滋病(AIDS)的第二大高死亡率的傳染性疾病。根據WHO 2015年度報告統計，2014年全球新發結核病患者960萬例，死亡高達150萬例[1]。盡管大部分的肺結核是可控可治的，但每年結核病的死亡率仍然很高。卡介苗(BCG)是目前惟一用于人結核病的預防性疫苗，初生嬰兒接種BCG可顯著降低兒童原發性肺結核、粟粒型肺結核和結核性腦膜炎的發病率和死亡率，但對于成人肺結核的保護效率差異極大，導致成人接種BCG 的效果較差[2]。因此，亟待研究開發新型高效的結核病預防疫苗。亞單位疫苗成分明確，可以誘導有效的免疫應答，由于亞單位疫苗的保護效果難以超過BCG，對優秀的Mtb抗原，可以構建亞單位疫苗，采用BCG初始免疫-亞單位疫苗增強免疫的策略，可以提高成人的免疫效果[3]。

本實驗室前期研究顯示，Rv3400抗原在結核病患者的血清學檢查中具有較高的敏感度和特異度。通過基因組比對發現，Mtb基因組中的一些片段在BCG 基因組中缺失，這些缺失片段被稱為差異區域(region of differences，RD)，Rv3400位于RD16區域，研究表明Rv3400作為水解酶，參與分枝菌酸合成途徑[4]。而Mtb的生長、致病性、耐藥性及抗酸特性都與菌株中所含的分枝菌酸有關，但是目前對其生物學功能還知之甚少。本實驗在體外用Rv3400抗原刺激巨噬細胞，顯示Rv3400抗原能促進細胞分泌高水平的白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，引發較強的免疫反應；另外選擇Rv3400和能引起強烈細胞免疫反應的弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)構建亞單位疫苗(Rv3400-IFA)，以觀察免疫動物的細胞免疫和體液免疫反應，初步評估其免疫效應，旨在尋找新型結核病亞單位疫苗，更好地預防結核病。

材料和方法

一、材料

1.菌株和細胞系：表達菌株大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS(北京全式金生物技術有限公司提供), 巨噬細胞系RAW264.7由本實驗室保存。

2.實驗動物：實驗動物為6～8周雌性C57BL/6清潔級小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，購買后飼養于復旦大學遺傳工程國家重點實驗室動物房。

3.主要試劑：pET-28a(+)質粒由本實驗室保存；H37Rv基因組由上海市肺科醫院提供；TransStart FastPfu DNA 聚合酶 (北京全式金生物技術有限公司提供)； EcoR I、HindⅢ (日本TaKaRa公司提供)；T4 DNA 連接酶 (美國New England Biolabs公司提供)；20×PBS(磷酸鹽緩沖液)(生工生物工程上海股份有限公司提供)；親和層析所用介質Ni-NTA(nitrilotriacetic acid，氨三乙酸) His·Bind resin(德國Novagen公司提供)；弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA； 德國Sigma公司提供)；Mouse IFN-γ、TNF-α ELISPOT kit(PVDF)(荷蘭U-CyTech biosciences公司提供)；小鼠淋巴細胞分離液(加拿大Cedarlane公司提供)。流式檢測所用熒光抗體： 異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯抗鼠CD62L抗體、聚乙烯(PE)/Cy5偶聯抗鼠CD8a抗體、PE偶聯抗鼠 CD44抗體、PE/Cy5偶聯抗鼠 CD4抗體 (美國eBioscience公司提供)； PE 偶聯抗鼠 CD80抗體、FITC 偶聯抗鼠 CD86抗體、FITC 偶聯抗鼠 CD40 抗體(美國BD Biosciences公司提供)；PE 偶聯抗鼠 I-A/I-E抗體 (美國eBioscience公司提供)；Mouse 預包被ELISA kit (深圳市達科為生物技術有限公司提供)。

二、方法

1.Rv3400的擴增及原核表達載體pET28a(+)-Rv3400的構建：以Mtb H37Rv的基因組序列為模板，用TransStart FastPfu DNA 聚合酶進行所需基因序列的擴增。上游引物的序列為：5′-CCGGAATTCATGGCGAACTGGTATCGCCC-3′(下劃線部分為EcoR I酶切位點)，下游引物序列為： 5′-CCCAAGCTTCTACAGCAGCTCGGCGAGAT-CG-3′(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點)，預期得到的目的片段大小為789 bp。用 EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切基因產物, 回收的目的片段與同樣酶切后的pET28a(+)載體連接, 轉化E.coliDH5α感受態細胞。挑選2個菌落, 分別接種于3 ml含50 μg/ml卡納霉素的LB(Luria-Bertani)培養液, 37 ℃ 振蕩培養過夜。堿裂解法提取質粒DNA, 用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒正確后，將重組質粒pET28a(+)-Rv3400送至上海睿迪生物科技有限公司測序，將測序正確的質粒轉化至E.coliBL21(DE3)PLysS感受態，挑選陽性克隆用于蛋白表達。

2. Rv3400蛋白的誘導表達及純化：將構建好的表達菌株BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400接到3 ml含50 μg/ml卡納霉素的LB培養液，過夜培養。將過夜培養物以1∶50的體積比稀釋后，37 ℃搖床，轉速為180 轉/min，培養至吸光度(A)在波長600 nm時=0.4～0.6，加入β-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.5 mmol/L，28 ℃誘導過夜，誘導產物通過12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行分析。按照上述確定的最佳條件擴大培養，離心收菌，用PBS將菌體重懸后進行超聲波破碎菌體，收集上清。利用Novagen公司的純化柱純化目的蛋白，將純化、透析后得到的蛋白樣品置于-70 ℃保存。

3. 細胞實驗：將培養好的巨噬細胞RAW264.7計數后以每孔5×105個細胞鋪24孔板，將細胞培養過夜后分別加入終濃度為1 μg/ml、10 μg/ml 的Rv3400抗原，陽性對照為用1 μg/ml 脂多糖(LPS)，陰性對照為未刺激的細胞，放置在37 ℃、 5% CO2、100%濕度的條件下靜置培養，分別于24、48、72 h后收集細胞，重懸于PBS中洗2～3次，加入相應的熒光標記抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸于PBS中，濾膜過濾進行流式細胞檢測表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達量；收集細胞上清ELISA 檢測細胞因子TNF-a、IL-6的分泌情況。實驗重復3次。

4. 免疫小鼠實驗：將小鼠按數字表法隨機分成3組，每組5只。選取本實驗室的優秀抗原Rv3425作為陽性對照組Rv3425組，實驗組Rv3400組，陰性對照組IFA組。免疫方法為皮下注射；免疫策略：用50 μg純化好的蛋白Rv3425、Rv3400和等體積IFA充分乳化混勻，陰性對照組每只小鼠免疫50 μl IFA。分別于第1、3、5周免疫3次，于第7周取小鼠眼球血處死小鼠，取脾臟分離脾淋巴細胞進行免疫指標的檢測。

5.檢測方法：(1)采用流式細胞術檢測脾淋巴細胞CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62LlowT細胞百分比。計數后的脾淋巴細胞懸液加入到12孔板中，每孔加入2.5×105個細胞(500 μl)，蛋白Rv3425、Rv3400刺激物濃度為10 μg/ml，混合均勻，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養36 h。離心后收集計數后培養的脾淋巴細胞并收集細胞沉淀，重懸于PBS中洗2～3次，加入相應的熒光標記抗體，避光孵育30 min，洗滌后重懸于PBS中，濾膜過濾進行流式細胞檢測，FlowJo7.6軟件分析結果。(2)采用ELISPOT檢測脾淋巴細胞細胞因子IFN-γ分泌水平。處死小鼠后，分離小鼠淋巴細胞，免疫細胞以2.5×105個細胞(500 μl)接種，加入同體積的蛋白刺激物(刺激物濃度為10 μg/ml，1640雙抗培養基稀釋至相應的濃度)，混合均勻，于37 ℃，5% CO2濕度培養箱中培養36 h，按照試劑盒說明書檢測脾細胞細胞因子分泌，板子干燥完全后，送至達科為生物技術有限公司讀板計數斑點。(3)采用ELISA檢測脾淋巴細胞上清細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌。收集細胞培養36 h的上清用于細胞因子檢測，按試劑盒說明書進行實驗操作，所用的試劑盒為mouse IFN-γ、TNF-α、IL-4預包被ELISA kit。(4)采用ELISA檢驗外周血免疫球蛋白抗體IgG、IgG1、IgG2b水平。采集小鼠眼球外周血并分離血清，用包被緩沖液稀釋抗原(Rv3425、Rv3400)至適當濃度(5 μg/ml)，每孔加入100 μl 抗原，4 ℃包被過夜，封閉1 h，按照對比稀釋的方法加入從1/400 開始對比稀釋的血清，孵育1 h，分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2b二抗抗體，孵育后顯色終止，450 nm處讀板，空白組為對照。

結 果

一、 Rv3400蛋白的誘導表達及純化

對經IPTG誘導的重組菌株BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400進行SDS-PAGE分析，在相對分子質量28 000處出現目的蛋白條帶，而空載體菌株BL21(DE)-pET28a(+)無此條帶。表明Rv3400基因在大腸桿菌中得到了成功表達。目的蛋白在細菌裂解上清和包涵體均有表達，主要在上清表達，收集上清用Ni-NTA 親和純化柱純化目的蛋白，得到較高純度的蛋白(圖1)。

M：蛋白質分子質量標準；1：未誘導重組BL21(DE)-pET28a(+)；2：未誘導重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400全菌；3：誘導后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400全菌；4：誘導后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400上清；5：誘導后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400沉淀；6：Ni-NTA 純化后的Rv3400蛋白(相對分子質量28 000)圖1 重組蛋白Rv3400純化的SDS-PAGE電泳分析

二、細胞實驗

1．流式細胞術檢測巨噬細胞表面分子CD80、CD86、CD40、主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ表達：用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原， 1 μg/ml LPS分別刺激巨噬細胞，放置在37 ℃、 5% CO2、100%濕度的條件下靜置培養24、48、72 h后，分別收集巨噬細胞進行流式細胞術檢測。未刺激的巨噬細胞做陰性對照。結果用FlowJo 7.6軟件分析，以未刺激的巨噬細胞表達CD80、CD86、CD40、MHCⅡ陽性細胞為基準畫門，得到1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原、1 μg/ml LPS刺激的巨噬細胞表達CD80、CD86、CD40、MHCⅡ陽性細胞百分比。檢測抗原刺激細胞后的3個時間相比，刺激24 h后的巨噬細胞表面分子表達量最高。如表1所示，與未刺激的巨噬細胞相比，用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原刺激巨噬細胞后的CD80表達量顯著提高，差異有顯著統計學意義(one-way ANOVA：F=104.198，P<0.01)；CD86、CD40、MHCⅡ的表達而言，用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原刺激巨噬細胞后表達量同樣顯著提高，差異有顯著統計學意義[one-way ANOVA：F=19.900，F=83.567，F=210.811，P值均<0.01]；說明Rv3400抗原可以促進巨噬細胞的分化成熟。

2． ELISA檢測細胞培養上清特異性TNF-α、IL-6的水平：收集不同抗原刺激的巨噬細胞培養上清，ELISA檢測細胞TNF-α、IL-6分泌情況。結果如表2所示，與未刺激的細胞相比，Rv3400蛋白刺激的巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的能力顯著升高。1 μg/ml Rv3400、10 μg/ml Rv3400抗原刺激的細胞TNF-α分泌水平與未刺激的細胞相比差異有顯著統計學意義(one-way ANOVA，F=377.715，P<0.01),；IL-6的分泌水平來說，10 μg/ml Rv3400抗原刺激細胞的分泌水平高于1 μg/ml Rv3400抗原刺激的分泌水平，差異有統計學意義；1 μg/ml Rv3400刺激的細胞IL-6分泌水平與未刺激的細胞IL-6分泌水平相比無統計學差異(one-way ANOVA，F=10.524，P<0.05)；未刺激的巨噬細胞TNF-α、IL-6的分泌水平極低。

表1 巨噬細胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達量(采用不同劑量Rv3400抗原刺激巨噬細胞24 h后與未刺激巨噬細胞表達量比較)

表2 采用不同劑量Rv3400抗原刺激巨噬細胞24 h后與未刺激組細胞因子分泌量

二、動物實驗

1.流式細胞術檢測脾CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62LlowT淋巴細胞分群：如圖2所示，Rv3400組的小鼠可以誘導CD4+、CD8+T淋巴細胞表面分子CD44顯著性上調和CD62L 顯著性下調。Rv3400組CD4+CD44+、CD8+CD44+雙陽性T淋巴細胞百分比[(44.20±11.95)%，(48.88±7.42)%]與對照組IFA組[(27.02±6.56)%，(30.57±6.00)%]相比，差異有統計學意義(one-way ANOVA，F=18.460，F=32.194；P<0.05，P<0.01)，T淋巴細胞表面的CD44受到特異性抗原刺激后表達明顯升高；CD62L的表達來說，Rv3400組小鼠T淋巴細胞CD4+CD62L+，CD8+CD62L+百分比[(43.56±11.90)%，(47.04±7.72)%]顯著性降低(one-way ANOVA，F=8.108,F=4.080；P<0.01，P<0.05),而對照組IFA組CD4+CD62L+，CD8+CD62L+T淋巴細胞比率為(62.60±4.73)%，(58.48±6.06)%。

one-way ANOVA，最小顯著性差異法(LSD)比較組間差異，a：P<0.05；b：P<0.01圖2 CD4+CD44high、 CD4+CD62Llow， CD8+CD44high、 CD8+CD62Llow T淋巴細胞百分比

2.ELISPOT方法檢測各組小鼠脾淋巴細胞特異性分泌IFN-γ的水平：在特異性抗原刺激下，實驗組小鼠Rv3400組脾淋巴細胞特異性分泌IFN-γ的細胞數[斑點形成細胞(sport forming cells, SFC)]顯著高于陰性對照組(成組t檢驗，t=2.859，P<0.05)，免疫效果與陽性對照組Rv3425組差異無統計學意義(圖3)

SFC/2.5×105細胞: 2.5×105個細胞中的SFC；成組t檢驗，a：P<0.05，b：P<0.01圖3 ELISPOT 檢測免疫小鼠脾淋巴細胞特異性分泌IFN-γ水平

3. ELISA檢測脾淋巴細胞培養上清特異性TNF-α、 IFN-γ、IL-4的水平：在特異性抗原刺激下，與對照組IFA組相比，Rv3400組小鼠有更好的TNF-α和IFN-γ的分泌能力，差異有統計學意義(成組t檢驗，t=2.578，P=0.033；t=8.587，P=0.003)；IL-4的分泌水平很低，且各組間的水平差異無統計學意義，說明Rv3400傾向于引起Th1型的免疫反應。

成組t檢驗，a：P<0.05；b：P<0.01圖4 ELISA 檢測小鼠脾淋巴細胞培養上清特異性細胞因子TNF-α、 IFN-γ、IL-4的分泌

4． ELISA檢驗外周血免疫球蛋白IgG、IgG2b/IgG1水平：用抗原Rv3400，Rv3425預包被ELISA 96孔板，對比稀釋血清，檢測小鼠血清中IgG的效價來評價抗原Rv3400引起小鼠體液免疫水平的變化。結果如圖5所示，Rv3400蛋白有較高的抗體IgG滴度，抗體效價達1∶409 600，與Rv3425的效果相當。說明抗原Rv3400能誘導小鼠產生特異性抗體。對IgG2b/IgG1水平來說,同組的血清IgG2b水平高于IgG1水平(如圖6)，比值為1.8，說明抗原Rv3400誘導小鼠Th1型免疫反應為主，而結核病的保護性免疫恰恰與一個強的Th1型T細胞反應的建立有關。

圖5 用抗原Rv3400、Rv3425預包被ELISA 96孔板，對比稀釋血清后血清中IgG抗體水平的檢測結果

討 論

結核病是當前危害人類健康的嚴重公共衛生問題，是世界上由單病原菌引起的死亡人數最多、造成危害性最大的疾病。而目前惟一使用的結核病預防疫苗卡介苗保護效果不理想，近年來結核病的發病率一直居高不下且致死率高，蛋白亞單位疫苗作為新型抗結核疫苗的一種，具有其安全性優勢，還可以特異性誘導CD4+T細胞和CD8+T淋巴細胞活化，是較為理想的疫苗之一[5]。

圖6 用抗原Rv3400、Rv3425預包被ELISA 96孔板，對比稀釋血清后血清中IgG2b、IgG1抗體水平的檢測結果

結核分枝桿菌是一種胞內寄生菌，在結核分枝桿菌入侵時，宿主會啟動第一道防線即天然免疫系統來抵抗結核分枝桿菌的感染，在天然免疫系統中，巨噬細胞、自然殺傷細胞等對于結核感染起重要作用[6]。結核分枝桿菌通過Toll樣受體(TLR)等模式識別受體, 激活巨噬細胞的天然免疫反應, 清除細菌和調節獲得性免疫反應。CD80、CD86是表達在抗原提呈細胞(APC)表面的重要協同刺激分子，是T細胞活化的必需共刺激信號。未受抗原刺激的APC幾乎不表達CD80、CD86分子，但經活化后CD80、CD86的表達顯著上調[7]。CD40可直接誘導共刺激分子CD80、CD86 的表達。有文獻報道, 表達于巨噬細胞表面的CD40與T細胞表面CD40L結合能促使溶酶體與吞噬小體融合, 促進病原體的清除[8-10]。CD40是在抗原提呈細胞表面的共刺激因子,其可以通過NF-kB上調IL-6、黏附分子CD54和抗凋亡蛋白的表達, 促進細胞增殖。巨噬細胞通過調節其表面分子如CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ來激活 Toll樣受體2通路，是機體激發固有免疫和適應性免疫的關鍵[11]；MHCⅡ是免疫系統調節的重要組成部分，巨噬細胞表面MHCⅡ的表達是完成抗原提呈的必須條件，分子抗原與抗原多肽結合并將抗原呈遞給CD4+T細胞，進而誘導其產生細胞因子[12]。

巨噬細胞在細胞免疫中還起到重要的效應器作用,在結核分枝桿菌和其他細胞因子的刺激下,能夠產生多種細胞因子，如: IL-6、TNF-α等[13]。TNF-α對于機體包圍感染部位防止擴散起到很重要的作用[14]。IL-6 和TNF-α、IL-1β一起啟動早期炎癥反應,增強T細胞和B細胞反應[15]。本研究用重組表達的抗原Rv3400蛋白體外刺激小鼠巨噬細胞系，顯示Rv3400可以誘導巨噬細胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達增加，提高巨噬細胞的抗原提呈能力，參與T細胞的激活。同時Rv3400刺激巨噬細胞能夠產生高水平的促炎因子IL-6和TNF-α的分泌。因此，結核桿菌特異性抗原Rv3400可以增強巨噬細胞的活性，更有效地激活T細胞，有利于機體識別結核分枝桿菌，抵抗結核分枝桿菌的早期感染。

本實驗將Rv3400蛋白與佐劑混合后免疫小鼠，實驗結果顯示Rv3400蛋白能夠有效誘導脾臟淋巴細胞產生特異性的IFN-γ和TNF-α, Rv3400組顯著高于對照組IFA組(P<0.01)，并且分泌水平顯著高于誘導產生的IL-4的分泌水平，呈現顯著的Th1型免疫應答趨勢。結核分枝桿菌為胞內寄生菌，一般認為在控制結核分枝桿菌感染過程中以CD4+T 細胞產生IFN-γ為特征的Th1 型免疫應答起重要作用[13-14]。IFN-γ是控制結核分枝桿菌感染的關鍵性Ⅰ型細胞因子，可以誘導Th0細胞向Th1 細胞分化[16],從而激活巨噬細胞，參與免疫應答。TNF-α作為主要的Ⅰ型細胞因子在宿主結核肉芽腫的形成和維持過程中起著關鍵作用。Th0細胞在IL-4的誘導下分化成Th2細胞。Th2細胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-6等促進B細胞的增殖分化和形成抗體，介導體液免疫應答。在IFN-γ的檢測中，筆者運用了ELISPOT和ELISA兩種檢測方法，檢測結果一致，都能很好地反映細胞產生IFN-γ的水平差異；ELISPOT作為ELISA的改良技術，更靈敏，結果更直觀。

免疫記憶是評價疫苗的重要因素，T細胞中CD44highCD62Llow的表達是評價一個疫苗免疫記憶效應的重要指標。本實驗表明，Rv3400/IFA免疫的小鼠脾淋巴細胞有更明顯的CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62Llow分群。CD44、CD62L 是效應型記憶T 細胞的表面標志[17]。一般來說，效應型記憶T細胞的表面表達CD44highCD62Llow表型。CD44是存在于淋巴細胞表面的蛋白，是淋巴細胞外滲到炎癥部位的重要調節因子。受到刺激后其上調是所有記憶T細胞的標志[18]。CD62L是被認為的是初始T細胞(即未接觸到特異性抗原的一類T細胞)表面的歸巢受體。其在T細胞群被激活后是下調的[19]。有研究表明，受到感染后CD4+、CD8+T細胞表面分子CD62L表達下調，CD44表達上調[18]。因此，抗原Rv3400顯示出很好的免疫記憶性。

本實驗采用間接ELISA對小鼠血清中的抗體效價進行檢測，Rv3400/IFA 組小鼠的抗體IgG滴度顯著高于對照組IFA組，抗體IgG效價水平高達1∶409 600說明亞單位疫苗Rv3400/IFA 不僅可以刺激小鼠的細胞免疫反應，又可以使小鼠體內產生高滴度的抗體水平。IgG1是依賴Th2途徑免疫應答的特征性標志, 而IgG2b是依賴Th1途徑免疫應答的特征性標志。本研究中免疫小鼠免疫Rv3400/IFA后，其IgG2b水平高于IgG1，說明抗原Rv3400誘導小鼠Th1型免疫反應為主，且可以引起持久的Th1型免疫反應。

綜上結果表明: 體外巨噬細胞實驗顯示, 抗原Rv3400能夠誘導高水平IL-6 和TNF-α的分泌，增加巨噬細胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達，提高巨噬細胞吞噬能力；抗原Rv3400聯合不完全佐劑IFA免疫小鼠后增強小鼠TNF-α、IFN-γ分泌能力，引起抗原特異性的Th1 型細胞免疫應答；小鼠有明顯的CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62Llow分群，顯示良好的免疫記憶性，同時促進血清IgG水平增加，可以引起強烈的體液免疫，Rv3400有望成為新的結核疫苗設計的候選抗原。

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(本文編輯：薛愛華)

Immunologenicity of specific antigen Rv3400 ofMycobacteriumtuberculosis

ZHULin,XUYing,KONGCong,SUHai-bo,HUANGQi,ZHUSheng-ling,WANGHong-hai.

SchoolofLifeSciencesFudanUniversity,Shanghai200438,China

Correspondingauther:WANGHong-hai,Email:hhwang@fudan.edu.cn

Objective To construct a subunit vaccine (Rv3400-IFA) by combining specific antigen Rv3400 ofMycobacteriumtuberculosiswith incomplete Freund’s adjuvant (IFA), to assess its immune effects in C57BL/6 mice and by infecting the macrophages RAW264.7 with antigen Rv3400. Methods TheRv3400 gene fragment was amplified by PCR, and inserted into plasmid pET28a(+). The protein Rv3400 was expressed inE.coliBL21 (DE3) pLysS and purified. The macrophages RAW264.7 were divided into 3 groups including positive control group [treated with 1 μg/ml lipopolysaccharides (LPS)], test group (treated with 1 μg/ml Rv3400), negative control group (no treated), the expression of cell surface markers was examined by flow cytometry, and cell culture supernatant was collected and detected the cytokines secreted by ELISA. Rv3400 protein and IFA were equally mixed and emulsified. The C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups with each group 5 mice including test group (treated with Rv3400-IFA), positive control group (treated with Rv3425-IFA), negative control group (treated with IFA), immunized 3 times at 2 week interval. The humoral and cellular immune responses in mice were analysed by enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT), ELISA and flow cytometry. Results (1) The Rv3400 protein was successfully expressed and purified. (2) The macrophages were stimulated with 1 μg/ml Rv3400 antigen, significantly improved the expression of surface markers CD80 [from (34.70±2.40)% to (90.45±7.71)%], CD86 [from (31.25±18.31)% to (90.10±4.10)%], CD40 [from (41.80±6.01)% to (89.97±7.79)%] and MHCⅡ [from (44.30±0.44)% to (85.13±5.12)%], and promoted pro-inflammatory cytokine production [TNF-α (49 217.0±390.61)pg/ml, IL-6 (1783.4±51.18)pg/ml]. (3) The spot forming cells (SFC) of IFN-γ in mice immunized with Rv3400-IFA was (136.20±95.09), significantly higher than that in IFA group (14.00±9.62) (t=2.859,P<0.01). The TNF-α and IFN-γ levels in spleen lymphocyte culture supernatants were (247.38±142.268)pg/ml and (325.45±75.19)pg/ml respectively, significantly higher than those in IFA group [(69.25±60.06)pg/ml and (2.22±1.28)pg/ml] (t=2.579，P<0.05；t=8.597，P<0.01). (4) The percentages of CD4+CD44high[(44.20±11.95)%], CD4+CD62Llow[(43.56±11.90)%], CD8+CD44high[(48.88±7.42)%] and CD8+CD62LlowT cells [(47.04±7.72)%] in Rv3400-IFA group were significantly higher than those in IFA group [(27.02±6.56)%，(62.60±4.73)%， (30.57±6.00)% and (58.48±6.06)%], (one-way ANOVA，F=18.460，F=8.108，F=32.194；F=4.080；P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05). (5) The serum IgG level in test group was as high as 1∶409 600. The level of IgG2b/IgG1 was 1.8. Conclusion The subunit vaccine Rv3400-IFA can induce strong humoral and cellular immune responses in C57BL/6 mice.MycobacteriumtuberculosisRv3400 protein may be a novel candidate antigen for designing the TB vaccine and diagnosing the TB．

Mycobacteriumtuberculosis; Rv3400; Subunit vaccine; Cellular immunity; Humoral immunity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.010

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10003008)

200438，上海，復旦大學生命科學學院

王洪海，Email：hhwang@fudan.edu.cn

2015-10-20)