基于“異類相制”的雷公藤復方配伍減毒代謝組學研究お

謝彤 周學平 林麗麗 徐建亞 沈存思 馮哲 周玲玲 單進軍

[摘要]采用基于氣相色譜質譜聯用技術（GCMS/MS）的代謝組學方法，分析雷公藤復方配伍前后對大鼠血漿中內源性代謝物的變化，以期闡明基于“異類相制”中醫理論的清絡通痹方對雷公藤的配伍減毒機制。通過GCMS/MS分析獲得空白對照組、雷公藤組和清絡通痹方組大鼠血漿代謝輪廓，正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）顯示3組在得分圖上區分明顯， 清絡通痹方組各觀測值存在著向正常組移動的趨勢，提示了清絡通痹方的配伍減毒功效。通過變量重要性投影（VIP）值和單因素方差分析篩選差異性代謝物，發現雷公藤組中生糖氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸等水平顯著升高，支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨基酸水平下降，清絡通痹方則能夠逆轉氨基酸水平的紊亂。進一步的代謝通路分析提示清絡通痹方配伍減毒機制可能與谷氨酸和谷氨酰胺代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關。該研究從代謝的角度，說明了雷公藤肝臟毒性的發生與氨基酸代謝，能量代謝等過程密切相關，而清絡通痹方通過改善機體氨基酸水平發揮配伍減毒作用。

[關鍵詞]異類相制；雷公藤；代謝組學；肝毒性；清絡通痹方

雷公藤作為中國傳統醫學中的一種常用中藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結的功效，臨床上廣泛用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、慢性腎炎等疾病。盡管雷公藤治療免疫系統疾病療效確切，卻存在明顯的肝毒性[12]。雷公藤的臨床治療窗較窄，對機體毒性損傷嚴重，是目前亟需解決的問題。在國醫大師周仲瑛的指導下，南京中醫藥大學周學平教授以臨床實踐為基礎，提出 “異類相制”的學術指導，即通過具有不同功效的中藥配伍來制約雷公藤毒烈偏頗之性的效用[34]。在此基礎上，周學平教授用青風藤15 g，生地15 g，三七10 g，僵蠶3 g與雷公藤5～15 g相配伍，組成“清絡通痹方”。該方在臨床上能夠明顯的降低雷公藤產生的肝毒性。該方中，三七散瘀止血、消腫定痛，生地清熱生津、滋陰養血，與雷公藤配伍能達到異效相制、扶正制毒的功效。周聰等通過加減配伍藥對的方法證實，在清絡通痹方中，生地和三七對正方配伍減毒的功效貢獻度最大[5]。盡管清絡通痹方配伍減毒的療效確切，然而目前都是從單一的信號分子通路去研究，缺乏整體的評價體系和研究方法。

代謝組學的發展給中醫藥毒性評價和毒性機制研究帶來新的機遇和挑戰[67]。運用代謝組學技術能夠從整體角度評價生物體產生的毒性變化，預測毒性產生，尋找毒性相關生物標志物，從而闡明毒性機制。Xiong等建立了GCMS的代謝組學方法全面表征對乙酰氨基酚誘導的肝毒性[8]；Gonzalez等建立的基于液相的代謝組學方法評價急性肝損傷可能發生的機制[9]。因此，本文在前期實驗的基礎上，運用代謝組學技術手段來闡述清絡通痹方配伍減毒的可能機制，為“異類相制”中醫理論的科學內涵提供技術支撐，為其他毒性中藥以及毒性中藥配伍理論的探討提供新的研究思路。

1材料

低溫高速離心機（Beckman，美國）；真空旋轉揮干儀（Speedvac，Thermo Savant，美國）；氣相色譜三重四級桿質譜聯用儀（GCMS/MS，Thermo，美國）；氣相毛細管柱為熔融的硅烷化石英毛細管（DB5固定相，018 mm×10 m，018 μm，Thermo，美國）。

1，213C2肉蔻酸（同位素內標）、鹽酸甲氧胺、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、N甲基N三甲基硅烷三氟乙酰胺（MSTFA）均購自SigmaAldrich，MSTFA含1%TMCS；甲醇和正庚烷（色譜純）均購自Merck公司（德國）；超純水（自制，Millipore，美國）；各鑒定用對照品、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）等其他試劑均為分析純。

雷公藤藥材產自四川西昌，批號120620；三七、地黃、僵蠶、青風藤藥材均購自安徽亳州中藥飲片廠，批號111208。經南京中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室劉圣金博士鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部中相關規定。

雌性SD大鼠30只，體重（200±20） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）20120001。

2方法

21動物實驗實驗開始前，30只雌性SD大鼠在屏障環境中適應7 d，自由攝取食和水。實驗開始時，將大鼠隨機分成3組，空白對照組、雷公藤組和清絡通痹方組，每組10只。每天早晨灌胃給藥10 mL·kg-1，連續28 d。實驗結束，取大鼠血漿于離心管中，置于-20 ℃冰箱保存備用。

22藥材提取臨床上雷公藤常用劑量為008～025 g·kg-1·d-1，前期試驗發現，10倍臨床劑量的雷公藤能夠誘導產生穩定、明顯的肝毒性（即08～25 g·kg-1·d-1），推算至相應的大鼠劑量為5～15 g·kg-1·d-1，因此本實驗選用雷公藤劑量為15 g·kg-1·d-1（即臨床最大劑量的10倍）。復方中其他配伍中藥仍然按照臨床劑量進行給藥。

雷公藤提取：稱取雷公藤1 500 g，加水12 L，水煎煮提取2次，每次2 h，放冷，合并2次濾液，濾過。濾液置于真空旋轉蒸發儀中濃縮，濃縮液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器和殘渣，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，搖勻。得到雷公藤生藥的質量濃度為15 g·mL-1，置于4 ℃冰箱，備用。

清絡通痹方提取：稱取雷公藤1 500 g、生地150 g、僵蠶30 g、青風藤150 g、三七100 g，混合，加水12 L，水煎提取2次，每次2 h，放冷，合并2次濾液，濾過。濾液置于真空旋轉蒸發儀中濃縮，濃縮液置于1 000 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器和殘渣，洗液置于同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到清絡通痹方（方中雷公藤生藥的質量濃度為15 g·mL-1）。置于4 ℃冰箱，備用。

23血漿樣品處理取大鼠血漿50 μL于15 mL離心管中，加入150 μL甲醇（含內標1，213C肉蔻酸25 mg·L-1），渦旋5 min后17 000 r·min-1離心10 min，取上清100 μL置于離心濃縮儀中揮干。向上述樣品中加入30 μL甲氧胺吡啶溶液（10 g·L-1），渦旋1 min后震蕩15 h。加入30 μL BSTFA（含體積分數為1%TMCS）溶液后，取上清用于GCMS/MS進樣分析。

24氣相色譜質譜條件載氣為氦氣，流速12 mL·min-1，分流比為20∶1，進樣口溫度為250 ℃，傳輸線溫度為250 ℃。EI離子源，溫度為280 ℃。電離能為70 eV，質譜采用一級全掃描的采集方式，m/z采集范圍50～500，采集時間35～19 min。程序升溫：起始溫度60 ℃，保持1 min后，以20 ℃·min-1速度升至320 ℃后，保持5 min。進樣量為1 μL。

25數據處理將各色譜峰的EI碎裂圖譜與NIST標準譜庫進行比對，對內源性成分進行結構確定。利用Xcalibur 21軟件（Thermo，美國）對色譜峰的保留時間進行相對定量。多元數據分析和建模均采用SIMCAP 120軟件（Umetrics， Sweden）完成。采用偏最小二乘判別分析（OPLSDA）來區分各組的樣本。最終用Splot以及VIP值來篩選差異性的代謝產物，并通過單因素方差分析最終確定差異內源性成分。

3結果與討論

31雷公藤肝毒性以及清絡通痹方配伍減毒生化結果生化檢測結果表明，雷公藤提取物能夠顯著引起血漿中谷丙轉氨酶（ALT）以及谷草轉氨酶（AST）的升高，而清絡通痹方則能夠逆轉轉氨酶的升高，提示該劑量下的雷公藤能夠誘發產生肝毒性，而清絡通痹方則能夠產生配伍減毒的作用，見圖1。

32血漿中內源性小分子化合物的測定在實驗過程中優化了進樣量以及分流比，發現在分流的情況下，以20∶1的分流比進樣，各色譜峰之間分離度較好，峰形佳。經過GCMS/MS分析得到血清總離子流圖，見圖2A。所得每個質譜碎裂圖與NIST標準譜庫比對，共鑒定出72個化合物，其中包含了大量的內源性代謝產物，例如氨基酸、糖類、脂肪酸以及三羧酸循環中間產物等。

33雷公藤及清絡通痹方對機體代謝的影響將空白對照組、雷公藤組和清絡通痹方組進行OPLSDA分析，得到2個主成分的模型分析（R2X：868%，Q2：647%），二維得分圖見圖2B。從圖中可以看到，雷公藤組、清絡通痹方組與空白對照組區分較為明顯，提示相比空白對照組，雷公藤組改變了正常大鼠血漿中內源性代謝物的水平，驗證了雷公藤具有明顯的肝臟毒性；以主成分1為參照，清絡通痹方組大鼠血漿中內源性代謝物具有向空白對照組移動的趨勢，說明復方配伍能夠逆轉雷公藤誘導產生的肝毒性。

34差異化合物的篩選分別比較了空白對照組和雷公藤組，以及雷公藤組和清絡通痹方組，繪制Splot圖，以VIP值大于10為標準尋找差異化合物，見圖3。結果發現，空白對照組和雷公藤組相比，葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺對模型的貢獻比較大；雷公藤組與清絡通痹方組比較，草酸、乳酸、葡萄糖、尿素、半乳糖醛酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸和脯氨酸對模型的貢獻度較大。

35代謝通路分析肝臟是氨基酸代謝的中心器官，肝臟發生損傷后，常發生氨基酸代謝的紊亂。使用Metabo Analyst 30 軟件（http：//www. metaboanalyst. ca/）進行了代謝通路分析。結果發現，在整個模型中谷氨酸和谷氨酰胺代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝影響較大，見圖4。谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸以及脯氨酸是機體的生糖氨基酸。雷公藤誘導產生肝毒性，蛋白質產生分解，使得部分的生糖氨基酸游離至血漿。清絡通痹方能夠逆轉氨基酸水平的升高，提示了配伍減毒的功效。相反，支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨基酸水平顯著降低[10]。慢性肝毒性的發生往往伴隨支鏈氨基酸合成異常，支鏈氨基酸作為肝毒性的指標之一，提示肝毒性的產生，而清絡通痹方并沒有能夠逆轉支鏈氨基酸的降低，說明清絡通痹方中其他成分可能會導致氨基酸的降低。

氨基酸代謝異常也影響機體的尿素水平。雷公藤導致機體蛋白降解，氨基酸水平升高，使得氨基酸脫氨基代謝增加，從而表現出尿素水平的升高。清絡通痹方配伍后，尿素水平顯著降低。

文獻報道雷公藤中的主要成分雷公藤甲素抑制線粒體功能從而產生肝毒性。本實驗中發現，雷公藤誘導使得機體的葡萄糖水平顯著上升，說明線粒體利用葡萄糖氧化產能受阻，表明雷公藤影響了能量代謝。3羥基丁酸是一種酮體，雷公藤抑制線粒體能量代謝，使得糖異生代謝途徑增加，酮體作為一種能量源，進入糖異生代謝通路，產能供機體使用，最終使得3羥基丁酸的含量降低，見圖5。

4討論

中醫在“七情”以及“君臣佐使”的理論基礎上合理配伍中藥，采用復方治療各種疾病。本實驗采用代謝組學技術手段，從整體微觀角度描述了雷公藤復方配伍前后大鼠血漿代謝輪廓的變化。研究結果表明，空白對照組、雷公藤組和清絡通痹方組大鼠血漿中內源性成分在OPLSDA得分圖中區分明顯，清絡通痹方能夠使代謝軌跡從雷公藤肝毒性向正常組轉移，提示清絡通痹方配伍減毒的作用。代謝通路結果提示，雷公藤主要影響了機體的氨基酸代謝以及能量代謝，而清絡通痹方則通過逆轉氨基酸代謝的紊亂發揮配伍減毒的作用。清絡通痹方基于中醫理論“異類相制”而提出。配伍方中，三七養血、止血、化瘀。現代藥理學研究表明，三七能夠改善肝臟微循環，促進肝臟蛋白質合成，從而達到保肝的作用，在方中發揮“異效制毒”的功效。這與本文中清絡通痹方通過糾正機體氨基酸水平的紊亂發揮配伍減毒的作用機制相符合，提示方中三七可能通過改善氨基酸代謝發揮“異效制毒”的機制。配伍方中，生地滋陰生津、止血抗凝。現代藥理學發現，生地改善機體的糖代謝。本文研究發現，雷公藤誘導使得機體能量代謝異常，葡萄糖、乳酸和羥基丁酸水平下降，而給予清絡通痹方后，乳酸水平表現升高趨勢，提示清絡通痹方可能改善了能量代謝，機體通過其他途徑如糖異生等代謝產能。這與方中生地的功效相符合，表明方中生地通過改善機體糖代謝發揮“扶正制毒”的功效。本實驗通過代謝組學技術和分析，從代謝的角度初步闡明雷公藤的肝毒性機制，進而探討其復方（清絡通痹方）配伍減毒機制，從整體微觀的角度闡明了中醫遣方用藥以及中醫理論的科學內涵，為其他毒性中藥的研究提供示范性思路。

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[責任編輯曹陽陽]