不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長和內(nèi)在品質(zhì)影響的研究お

李蒙蒙 郭巧生 史紅專 王嘉 戴道新 閆士猛 齊恒基 蘆鑫 劉立濤

[摘要]采用生物量測定、3，5二硝基水楊酸比色法、對棕櫚酸硝基苯酯（ρNPP）比色法、福林酚法等方法研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長、消化酶活性、生化指標(biāo)和內(nèi)在品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：螞蟥的最終質(zhì)量，特定生長率（SGR），增重率（WGR），淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶活力，SOD，CAT，ALP酶活性與密度呈反比，與換水頻率呈正比（P<005）；換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負(fù)相關(guān)，與溶氧量呈正相關(guān)；養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著。因此，每畝50萬條為較適宜的養(yǎng)殖密度，每72 h 1次為較適宜的換水頻率。

[關(guān)鍵詞]螞蟥；養(yǎng)殖密度；換水頻率；生長；消化酶；抗逆酶

螞蟥Whitmania pigra Whitman，又名寬體金線蛭，屬于環(huán)節(jié)動物門黃蛭科動物[1]，其干燥全體為中藥材水蛭，是《中國藥典》2015年版水蛭藥材收載主要來源，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效[2]。由于市場對水蛭藥材的巨大需求以及環(huán)境污染的日益加重，導(dǎo)致野生螞蟥資源瀕臨枯竭。目前雖然螞蟥室外人工養(yǎng)殖技術(shù)取得了初步成功，但仍存在許多諸如水溫、光照等不可控因素，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。近幾年來有關(guān)螞蟥適宜生長的溫度、呼吸和消化等生理特性以及分子生物學(xué)都進(jìn)行了相關(guān)研究 [38]，但鮮見養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長影響的相關(guān)研究報道，本實驗擬研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長和內(nèi)在品質(zhì)的影響，以期為螞蟥室內(nèi)養(yǎng)殖提供參考和依據(jù)。

1材料

螞蟥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所提供，經(jīng)郭巧生教授鑒定為螞蟥W pigra；螺螄（采自南京前湖，野生）經(jīng)郭巧生教授鑒定為梨形環(huán)棱螺Bellamya purificata Heude；曝氣24 h的自來水。

電子天平（山海精密儀器廠）、5810R離心機(jī)（eppendorf）、756CRT紫外分光光度計（上海精密儀器有限公司）、FA1104分析天平（上海精科天平廠）、勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、pH計（青島昱昌科技有限公司）、FW100小型高速粉碎機(jī)（天津華鑫儀器廠）、KQ250B超聲儀（昆山市超聲儀器公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、HHS型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、MR210A溶氧測量儀（南京特安科貿(mào)有限公司）、YC07型水質(zhì)分析儀（青島昱昌科技有限公司）。

DNS試劑、ρNPP溶液、福林酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、連苯三酚、324 mmol·L-1鉬酸銨溶液、50 mmol·L-1對硝基苯磷酸二鈉。

2方法

21實驗設(shè)計實驗在室內(nèi)進(jìn)行，容器為容積2 L的塑料瓶（瓶底面積133×10-2 m2，實際養(yǎng)殖用水1 L，水深12 cm），實驗螞蟥體重為（095±016） g。設(shè)5個養(yǎng)殖密度，分別為1（按照瓶底面積算，相當(dāng)于5萬條/畝），5，10，15，20條/瓶，分別標(biāo)記為SD1，SD2，SD3，SD4，SD5組，每個處理重復(fù)10次，24 h換水1次。設(shè)置5個換水頻率，分別為每隔12，24，48，72，96 h 換水1次，每次換水1 L，每瓶10條螞蟥，每個處理重復(fù)10次，分別標(biāo)記為H1，H2，H3，H4，H5組。實驗期間其他管理方法相同，投喂經(jīng)自來水暫養(yǎng)3 d后的新鮮螺螄，實驗時間40 d，期間保持室溫（25±1） ℃。

22樣品的采集和保存實驗結(jié)束時，每個平行組隨機(jī)取10條螞蟥，將活螞蟥于冰盤內(nèi)解剖，取消化道，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，稱重，冰浴中勻漿，用生理鹽水稀釋成含原漿20%的溶液，冷凍離心10 min（轉(zhuǎn)速為1萬r·min-1），取上清液為酶液，置于4 ℃冰箱中保存，并在24 h內(nèi)測定完成。

每個平行組隨機(jī)選取15條螞蟥，在50 ℃條件下干燥24 h，粉碎后過40目篩，置于試劑瓶中干燥避光保存，用于測定內(nèi)在品質(zhì)。

23生長性能的測定分別在實驗開始和結(jié)束時稱量各瓶中螞蟥的體重，計算出平均質(zhì)量，由公式計算特定生長率（SGR）和增重率（WGR）。SGR=（lnWt-lnW0）/t×100%；WGR= （Wt-W0）/W0×100%，式中W0為實驗開始時螞蟥的平均質(zhì)量（g），Wt為結(jié)束時螞蟥的平均質(zhì)量（g），t為實驗天數(shù)（d）。

24消化酶活性的測定方法蛋白酶活性測定采用福林酚法[9]在37 ℃，pH分別為32，92時，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）；淀粉酶的活力測定采用3，5二硝基水楊酸比色法[9]在37 ℃時，單位體積酶量，每分鐘水解淀粉生成1 mg還原糖的產(chǎn)量為1個酶活力單位（U）；脂肪酶活力測定采用對棕櫚酸硝基苯酯（ρNPP）比色法[10]在37 ℃，pH 82時，每分鐘催化釋放1 μmol對硝基酚所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

25超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性測定方法SOD活性測定采用鄭碧玉等[11]的方法，25 ℃下，1 mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量定為1個活力單位（U）。CAT活性采用比色法測定[12]，每分鐘分解1 μmol的過氧化氫即為1個酶活力單位（U）。ALP活性測定參考芶琳等[13]的方法，30 ℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol的對硝基酚，為1個酶活力單位（U）。

組織勻漿液的蛋白含量以考馬斯亮藍(lán)比色法測定。

酶的比活力=酶活力/蛋白含量

26螞蟥內(nèi)在品質(zhì)的測定方法參考《中國藥典》[2]2015年版一部測定水蛭藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH、抗凝血酶活性。

27水體質(zhì)量的測定每個處理組換水時測定水體質(zhì)量。使用溶氧儀測定水中溶氧量；使用水質(zhì)分析儀測定水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫的含量。

28數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2013和SPSS 190（Oneway ANOVA，多重比較采用Duncan′s法）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3結(jié)果與分析

31不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長性能的影響SD1特定生長率和增重率顯著大于其他4組（P<005），SD2的特定生長率與SD3沒有差異，與SD4和SD5相比有顯著性差異（P<005）。換水頻率與最終體重、特定生長率和增重率成反比，其中H5顯著小于H1和H2（P<005），其他各組之間沒有顯著性差異，見表1。

32不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥消化酶活性的影響消化酶活性與密度基本成負(fù)相關(guān)。其中淀粉酶：SD1最高，與其他4組均有顯著性差異（P<005），SD3，SD4和SD5之間沒有顯著性差異，但均與SD2有顯著性差異（P<005）；脂肪酶：除SD1和SD2，SD4和SD5之間無顯著差異外，各組別之間均顯著差異（P<005）。酸性蛋白酶：SD1，SD2，SD3組顯著高于SD4和 SD5組（P<005），其他各組之間無顯著性差異。堿性蛋白酶：SD1顯著大于其他各組（P<005），其中SD2，SD3與SD4，SD5相比有顯著性差異（P<005），見表2。消化酶活性與換水頻率基本成正相關(guān)。其中淀粉酶：H1顯著高于其他4組（P<005），其中H4，H5淀粉酶活性顯著小于H2，H3（P<005）；H1的脂肪酶活性和堿性蛋白酶活性顯著高于其他各組（P<005）；H5酸性蛋白酶活性顯著小于H1，H2（P<005）。

33不同養(yǎng)殖密度對螞蟥抗逆酶活性的影響抗逆酶活性與密度基本成負(fù)相關(guān)。SD4，SD5的SOD活性，顯著小于其他各組（P<005）。SD2，SD3的CAT活性顯著小于SD1（P<005），顯著大于SD4，SD5（P<005）。SD1，SD2的ALP活性顯著高于其他各組（P<005），見表3。抗逆酶活性與換水頻率基本成正相關(guān)。H4，H5組SOD活性顯著小于其他各組（P<005）；H1，H2組CAT顯著高于其他各組（P<005）；H1組ALP活性顯著高于其他各組（P<005）。

34不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對水蛭內(nèi)在品質(zhì)的影響?zhàn)B殖密度和換水頻率對水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著，見表4。

35不同換水頻率對水體質(zhì)量的影響換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負(fù)相關(guān)，與溶氧量呈正相關(guān)，各組之間呈顯著性差異（P<005），見表5。

4討論

41不同養(yǎng)殖密度對螞蟥生長和消化酶活性的影響?zhàn)B殖密度是影響水生生物生長的一個重要因素[1415]，研究發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖密度增大，群體內(nèi)的競爭加劇，對個體攝食產(chǎn)生負(fù)面影響[16]。本研究結(jié)果顯示，螞蟥特定生長率與養(yǎng)殖密度成反比、與換水頻率成正比，與孫學(xué)亮等[17]關(guān)于半滑舌鰨、張?zhí)鞎r等[18]對中國對蝦和肖鳴鶴等[19]關(guān)于克氏原螯蝦的研究結(jié)果相似。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖密度的增加，螞蟥種群間的個體差異度增大，Brett[20]認(rèn)為這是由于種群內(nèi)個體爭奪有限的食物資源，使小個體不能夠獲得充足的食物，從而導(dǎo)致個體間的生長差異，此外高密度組螞蟥由于組內(nèi)個體之間競爭增大可能導(dǎo)致能量消耗增加，進(jìn)而生長率下降。

Fendersen[21]等研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖會引起生物行為和生理變化，從而對養(yǎng)殖生物生長產(chǎn)生有害的影響。消化酶活性是衡量消化能力的重要指標(biāo)[22]，本實驗結(jié)果顯示密度與螞蟥消化酶活性成反比，與肖鶴鳴等[19]的報道相似，因此可能高密度組螞蟥組間個體競爭加劇導(dǎo)致消化酶活性降低從而使攝食量減少或消化不良，進(jìn)而影響了生長。

42不同換水頻率對螞蟥生長、消化酶活性、水體質(zhì)量的影響換水頻率的增加能有效的增加水體中的氧含量，水體中溶解氧含量豐富會使氧化分解作用活躍，加速水中污染物的降解[23]。李健等[24]報道水體中氨氮、硫化氫等有害物質(zhì)的含量與溶解氧有密切關(guān)系，水中溶氧量減小使NH4+N和NO2-N等積累 [2527]。吳垠等[28]發(fā)現(xiàn)水中溶氧量下降時虹鱒幼魚生長下降，姚雪梅等[29]報道NO2-濃度大小與海參的生長呈負(fù)相關(guān)。本實驗顯示換水頻率與水中溶氧量呈顯著負(fù)相關(guān)，與氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈正相關(guān)，與以上實驗結(jié)果相符合。雖然換水頻率和水體質(zhì)量的研究報道較多，但目前為止鮮見換水頻率和消化酶的相關(guān)性研究，本實驗顯示換水頻率與螞蟥的SGR和消化酶呈正相關(guān)（P<005），推測換水頻率在對水質(zhì)造成影響的同時，抑制了螞蟥消化酶活性，影響了螞蟥的進(jìn)食和消化，進(jìn)而影響其生長。

43不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥抗逆酶活性的影響免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是一種幫助魚類應(yīng)對損傷的自適應(yīng)和修復(fù)機(jī)制[30]，過高的養(yǎng)殖密度會成為一種脅迫，影響魚類的免疫系統(tǒng)和抗氧化能力[31]。活性氧通過影響細(xì)胞膜功能和酶活性使細(xì)胞加速老化和凋亡，活性氧增加時會誘導(dǎo)魚類抗氧化酶分泌，包括SOD，CAT[3132]，ALP在動物體內(nèi)普遍存在，參與磷酸基團(tuán)的代謝，也是溶酶體的組成部分，在免疫反應(yīng)中具有重要作用[33]。本研究表明SOD，CAT和ALP隨著養(yǎng)殖密度的增大和換水頻率的減少呈現(xiàn)減小趨勢，這與曹陽等[34]關(guān)于俄羅斯鱘幼魚、彭士明等[35]關(guān)于銀鯧魚、吳宗凡等[36]關(guān)于鯽的報道相似，可能是螞蟥在慢性脅迫過程中，螞蟥免疫機(jī)制失調(diào)導(dǎo)致SOD，CAT，ALP活力降低，如王文博等[37]報道短期擁擠脅迫會使鯽魚血液溶菌酶水平升高，長期脅迫則出現(xiàn)下降，至于短期脅迫對螞蟥免疫機(jī)制的影響有待今后進(jìn)一步研究。

44不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥內(nèi)在品質(zhì)的影響本研究的結(jié)果表明，養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥內(nèi)在品質(zhì)的影響都不顯著，其中水分、總灰分、酸不溶性灰分含量都低于2015年版《中國藥典》，說明雜質(zhì)含量低。抗凝血酶活性均高于2015年版藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明所得水蛭品質(zhì)優(yōu)良。綜上可知實驗所得螞蟥內(nèi)在品質(zhì)都能滿足2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

5小結(jié)

本實驗結(jié)果顯示密度為SD1時螞蟥生長性能最高，但最終產(chǎn)量（413 kg/畝）小于SD3組（1 384 kg/畝），換水頻率H4組對螞蟥生長的影響與其他4組沒有顯著性差異，如果大規(guī)模養(yǎng)殖，從經(jīng)濟(jì)效益和成本控制來說，選擇SD3密度、H4換水頻率是最佳的組合。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]