移植NEP基因轉染的神經干細胞對AD大鼠行為學的影響①

柳朝陽，陸宏軍，榮光影，張　濤，孫法明

(佳木斯大學，黑龍江佳木斯154007)

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移植NEP基因轉染的神經干細胞對AD大鼠行為學的影響①

柳朝陽，陸宏軍，榮光影，張濤，孫法明

(佳木斯大學，黑龍江佳木斯154007)

關鍵詞:NEP基因;神經干細胞; AD大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)病理過程的關鍵問題是患者腦中β－淀粉樣多肽(Aβ)的異常增加和沉積［1］。中性內肽酶(NEP)是腦內最重要的Aβ降解酶，是影響腦內Aβ分解代謝速率的限制因素［2］。神經干細胞(neural stem cell，NSC)是具有向多種細胞系分化又具有自我更新能力的細胞［3］。NSCs治療AD是運用其特性修復和替代受損的神經細胞，另外，NSCs是非常理想的基因載體，擁有許多其他載體所沒有的優點。本實驗將NEP基因轉染的神經干細胞移植到AD大鼠側腦室，觀察行為學的變化，為阿爾茨海默病的治療提供新的依據。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔SD大鼠由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2主要試劑

胎牛血清、Aβ1－40、神經干細胞基礎培養基、神經干細胞完全培養基、神經小球分散試劑盒等均購于美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立［4］

選左側海馬CAI區為注射區:根據Pellegrino和Cusmhna的大鼠腦立體定位圖譜，確定本研究中的注射坐標為前囪后3.3mm，中線左側2.2mm，硬腦膜下2.8mm。用微量加樣器緩慢注射Aβ－40溶液1μL，之后緩慢撤針，充分消毒，縫合皮膚。術后常規飼養，待兩周后做細胞移植。

1.3.2分組和細胞移植

30只AD大鼠在隨機分為3組，每組各10只: AD模型組、移植神經干細胞組(NSCs組)和移植NEP基因轉染神經干細胞組(NEP－NSCs組)。選左側海馬CAI區在3組AD大鼠分別微量植入6μL細胞培養液、NSC懸液及NEP－NSC懸液(濃度約為1×105個細胞/μL)，注射完畢后，全層縫合頭皮，腹腔注射青霉素，術后放置于溫暖安靜處至清醒。每組大鼠術后第8周進行實驗。

1.3.3隱蔽平臺實驗［5］

實驗期限為6d。實驗前讓大鼠自由游泳1分。在水迷宮象限的中央固定隱蔽平臺的位置，將每只大鼠頭朝外壁在任何一個象限內的隨機位置放入水中，大鼠爬到平臺上或到達60秒時，實驗立即停止。大鼠自己爬到平臺或操作人員引導使其爬上平臺后停留10秒。每天訓練4次，每次間隔30min。通過影像系統記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。此實驗用于測量動物在水迷宮中的學習和記憶能力。

1.3.4空間探索實驗

第7天在水迷宮中撤除平臺，將動物在任意一個入水點將放入水中，檢測60秒時間內，大鼠出現在目標象限(target quadrant，TQ)的百分比。此實驗用來檢測動物保持記憶能力。

1.4統計學方法

采用SPSS 11.3軟件分析，各組間統計分析應用t檢驗。實驗數據以珋±s表示。

2　結果

2.1行為學測試

與AD模型組相比，NEP－NSCs組和NSCs組的AD大鼠在第4、5、6天的平均潛伏期均明顯縮短(P＜0.05)，以NEP－NSCs組尤為明顯，且NEPNSCs組的AD大鼠在第4、5、6天的平均潛伏期亦明顯比NSCs組縮短(P＜0.05)。

表1　各組大鼠在移植術后第8周的隱蔽平臺實驗1～6d的平均潛伏期(珋±s，n =10)

表1　各組大鼠在移植術后第8周的隱蔽平臺實驗1～6d的平均潛伏期(珋±s，n =10)

注:與AD模型組比較a)P＜0.05;與NSCs組比較b)P＜0.05。

1d　2d　3d　4d　5d　6d AD模型組　32.43±15.72　 28.22±20.71　 28.29±13.91　 26.03±8.91　 22.76±11.75　 17.64±6.02 NSCs組　30.51±13.82　 26.61±17.91　 24.67±10.94　 21.46±5.19a)　17.43±5.69a)　14.15±2.04a)NEP－NSCs組　28.43±12.72　 23.75±14.96　 21.59±1.89　 14.61±3.07a) b)　12.62±3.32a) b)　10.61±1.03a) b)

2.2空間探索實驗

與AD模型組相比，NSCs組和NEP－NSCs組AD大鼠在目標象限探索時間的百分比有所增加，以NEP－NSCs組明顯，但無統計學差異(P＞0.05)。

表2　各組大鼠在探索實驗中在TQ象限中搜索時間所占百分比(x珋±s，n =8)

3　討論

本實驗中Aβ海馬CAI區微量注射制備AD大鼠模型，將NEP基因轉染的神經干細胞移植到AD模型大鼠側腦室區，通過隱蔽平臺獲得實驗和空間搜索實驗評價NEP基因轉染對AD大鼠學習記憶的影響。實驗結果顯示:隱蔽平臺獲得實驗中，與AD模型組相比，NEP－NSCs組和NSCs組在第4、5、6天的平均潛伏期均明顯縮短(P＜0.05) ;與NSCs組相比，NEP－NSCs組第4、5、6天的平均潛伏期亦明顯縮短(P＜0.05)。這表明NEP－NSCs組和NSCs組均能顯著改善AD大鼠的學習和記憶功能?？臻g探索實驗中，與AD模型組相比，NEPNSCs組和NSCs組在TQ象限搜索時間的百分比有所增加，但無統計學意義。水迷宮實驗表明，海馬移植了轉染NEP基因的神經干細胞后，可以明顯改善AD大鼠的學習和記憶功能，原因是由于海馬移植了轉染NEP基因的的神經干細胞后，可以高表達NEP蛋白，NEP蛋白是Aβ降解酶，因此可以減少Aβ在皮層及海馬區的沉積，降低了Aβ對神經系統的毒性作用。從而改善和提高了AD大鼠的學習和記憶功能。

參考文獻:

［1］Debora D，Jean－Paul N.Proteomic analysis of cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients［J］.Proteomics，2004，4: 2117－2124

［2］Wasinger V C，Cordwell S J，Cerpa－Poljak A，et al.Progresswith gene－product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma gen－italium ［J］.Electrophoresis，1995，16(7) : 1090－1094

［3］張維燁，李艷君，陳立強.神經干細胞分化研究進展［J］.黑龍江醫藥科學，2005，28(3) : 89－90

［4］朱飛奇，馬英，錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ 1－40建立阿爾茨海默病動物模型［J］.鄖陽醫學院學報，2008，28(2) :106－108

［5］李萍.阿爾茨海默氏病大鼠模型的建立及行為學評價［J］.寧波大學學報，2011，24(2) : 103－106

(收稿日期:2016－02－02)

通訊作者:張濤(1971～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E－mail: ztlzy1971@163.com。

作者簡介:柳朝陽(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師。

基金項目:①1.黑龍江省衛生廳科研項目，編號: 2009－336; 2.黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目，編號: 1252G059 ; 3.黑龍江省自然科學基金資助項目，編號: H2015074; 4.佳木斯大學科技重點項目，編號: Sz2011－009。

中圖分類號:R285.5; R73－36

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0133－01