正常大鼠的骨髓間充質干細胞對去勢大鼠骨髓間充質干細胞成骨成脂分化的影響①

張立超，賀　濤，帥　逸，常赫然，杜曉巖

(1.佳木斯大學附屬第二醫院頜面外科，黑龍江佳木斯154002;2.遵義醫學院附屬口腔醫院牙周科，貴州遵義563000; 3.第四軍醫大學組織工程研發中心，陜西西安710032)

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正常大鼠的骨髓間充質干細胞對去勢
大鼠骨髓間充質干細胞成骨成脂分化的影響①

張立超1，3，賀濤2，3，帥逸3，常赫然1，3，杜曉巖1

(1.佳木斯大學附屬第二醫院頜面外科，黑龍江佳木斯154002;2.遵義醫學院附屬口腔醫院牙周科，貴州遵義563000; 3.第四軍醫大學組織工程研發中心，陜西西安710032)

摘要:目的:為研究正常大鼠的骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)分泌的細胞因子對去勢后大鼠的骨髓間充質干細胞BMMSCs成骨成脂分化能力的影響及機制。方法: 12只雌性SD大鼠隨機分為假手術(sham)組，去勢(ovx)組。建立sham和ovx模型。術后2個月取sham組和ovx組大鼠BMMSCs，分為sham(A)組、ovx(B)組、ovx細胞+ sham培養液(C)組、sham細胞+ ovx培養液(D)組進行間接共培養，RT－PCR檢測各組BMMSCs成骨成脂相關基因; Western blot檢測各組BMMSCs成骨成脂相關蛋白; Western blot檢測Wnt經典信號通路相關蛋白。油紅染色;茜素紅染色。結果:成骨相關基因及蛋白表達以及Wnt經典通路的相關蛋白β－catenin和active－β－catenin組明顯高于B組，D組低于A組;成脂相關基因及蛋白表達C組明顯低于B組，D組高于A組。油紅染色、茜素紅染色結果與基因、蛋白的結果相一致。結論:正常大鼠BMMSCs分泌的細胞因子能夠通過激活Wnt經典信號通路促進ovx大鼠BMMSCs的成骨分化并抑制其成脂分化。

關鍵詞:骨質疏松;成骨分化;成脂分化;經典WNT信號通路

帥逸等發現通過靜脈注射外源性BMMSCs能夠緩解去卵巢大鼠的骨質疏松［1］，而外源性BMMSCs改善OVX大鼠BMMSCs成骨分化的機制尚不明確。研究表明，BMMSCs移植到體內大多數很快會死亡，而BMMSCs的治療效果卻能持續很久［2］。本研究目的是明確正常大鼠骨髓間充質干細胞是否通過分泌的細胞因子來改善去勢大鼠的骨質疏松。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級雌性SD大鼠12只，年齡10周，體重約200g［第四軍醫大學實驗動物中心］，α－MEM培養基和胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，茜素紅(天津科密歐公司)，油紅，Trizol reagent(invitroge公司)，反轉錄試劑盒(Toyobo公司)，β－甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素C，3－異丁基－1－甲基黃嘌呤和吲哚美辛(Simgo公司)，胰島素(萬邦制藥)，大鼠β－actin，OCN，RUNX2引物(上海生工)，大鼠堿性磷酸酶，RUNX2，SP7，β－Catenin，active－β－Catenin，PPAR－γ抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1構建ovx和sham模型: ovx組10周大鼠麻醉后備皮，在肋骨下一指寬、脊柱雙側一指半寬處切開，切除卵巢，縫合; sham組切開后不摘除卵巢，其余操作相同。飼養2個月。

1.2.2 BMMSC的培養:全骨髓貼壁培養法。以2 ×107個接種于75cm2的培養瓶中，含10%胎牛血清的α－MEM培養基，至于37℃、5% CO2濃度的培養箱，24h換液，細胞生長至80%傳代。收集sham組和ovx組培養液。

1.2.3 BMMSC的間接共培養: sham組和ovx組細胞分別接種于6孔板中，分為sham(A)組、ovx(B)組、ovx細胞+ sham培養液(C)組、sham細胞+ ovx培養液(D)，共培養48h。

1.2.4 BMMSC成骨成脂能力的檢測:以每孔1× 105個細胞接種于12孔板。成骨誘導7d，ALP染色，成骨誘導21d，茜素紅染色，觀察染色能力;成脂誘導7d，油紅染色，鏡下觀察脂滴形成。

1.2.5 RT－PCR法檢測成骨成脂相關基因表達:成骨誘導7d，Trizol法提取RNA，反轉錄，實時定量擴增OPG，OCN、Runx2;成脂誘導3d，Trizol法提取RNA，反轉錄，實時定量擴增LPL和PPAR－γ。

1.2.6 Western blot法檢測成骨成脂相關蛋白表達:成骨誘導7d，Western blot法檢測堿性磷酸酶，Runx2，SP7的表達;成脂誘導7d，Western blot法檢測PPAR－γ的表達。

1.2.7成骨成脂相關通路標志蛋白的檢測: Western blot法檢測各組成骨成脂誘導中WNT/β－catenin信號通路標志蛋白β－catenin，Active－β－catenin的表達。

2　結果

2.1骨質疏松模型建成: OVX組大鼠與sham組相比，骨密度下降明顯; sham組骨密度無明顯變化。

2.2正常大鼠BMMSC分泌的細胞因子等能夠促進OVX大鼠BMMSC成骨分化而抑制其成脂分化

2.2.1正常BMMSC分泌的細胞因子能促ovx細胞成骨抑成脂:茜素紅染色結果顯示C組顏色較B組顏色深，D組較A組淺(圖1) ;油紅染色顯微鏡下結果顯示C組油滴較B組少，D組較A組多(圖2)。

2.2.2正常BMMSC分泌的細胞因子能促進ovx細胞成骨基因表達: C組成骨基因RUNX2、OCN表達明顯高于B組，D組略低于A組; C組成脂基因PPAR－γ、LPL表達明顯低于B組，D組略高于A組(圖3)。

2.2.3正常BMMSC分泌的細胞因子能促進ovx細胞成骨蛋白表達: C組成骨蛋白RUNX2、SP7明顯高于B組，D組略低于A組; C組成脂蛋白PPAR－γ明顯低于于B組，D組略高于A組(圖4)。

圖1　茜素紅染色成骨能力對比

圖2　顯微鏡鏡下10×油紅O染色成脂能力對比

圖3　成骨成脂基因表達對比

圖4　成骨成脂蛋白對比

2.3正常細胞分泌的細胞因子等能夠激活OVX大鼠BMMSC的WNT/β－catenin通路促進成骨分化同時抑制成脂分化:成骨成脂中，C組β－catenin的表達B組與C組差異不明顯，C組Active－β－catenin的表達明顯高于B組，D組低于A組(圖5)。

圖5　經典WNT通路活化水平對比

3　討論

研究表明，雌激素缺乏時，機體內環境改變，內源性BMMSC成骨能力下降，破骨細胞增多，引起骨改建紊亂，形成骨質疏松［3～5］。無論骨質疏松癥患者及動物模型其BMMSCs的成骨能力都是下降的。如果能夠恢復內源性BMMSCs的成骨分化能力能夠極大的緩解甚至治愈骨質疏松癥。帥逸［1］等通過從大鼠尾靜脈系統注射BMMSCs，發現系統注射正常的BMMSCs能夠使相關的成骨基因表達上升，MICRO CT結果顯示骨小梁增多且骨密度上升，這說明系統注射BMMSCs確實能夠極大的緩解大鼠骨質疏松癥。關于干細胞的研究有很多［6］，干細胞治療也應經在許多疾病中應用［7］，系統注射BMMSCs后主要轉移到肺部，并且很快就消失［2］，但是BMMSCs的治療效果會持續很長時間。

正常的BMMSCs能夠分泌很多細胞因子［8，9］，本實驗結果顯示，去勢后大鼠的BMMSC成骨能力降低而成脂能力升高;加入培養過正常BMMSC的培養液后，內源性BMMSC的成骨能力增強而成脂能力降低，這表明正常BMMSC分泌的細胞因子等能夠改善內源性BMMSC成骨分化能力同時抑制其成脂能力;成骨成脂誘導后，同OVX組相比較，加入正常BMMSCs培養液的C組的WNT經典通路的標志蛋白Active－β－catenin、p－GSK－3β表達上升，WNT信號通路的活化程度較OVX組高。前文提到，WNT經典信號通路能夠調節BMMSC的成骨成脂分化，當其激活時，能夠促進BMMSC的成骨細胞分化并抑制其向成脂細胞分化。本實驗表明，正常BMMSC分泌細胞因子，并且這些細胞因子能夠表現出促進內源性BMMSC成骨同時抑制其成脂的效果是通過增強經典WNT信號通路來實現的。本實驗闡明了系統注射正常BMMSCs能夠恢復內源性BMMSCs成骨分化能力的機制，為BMMSC系統注射治療骨質疏松提供了理論基礎;最近的研究表明，系統注射BMMSC治療存在風險，例如，通過靜脈注射MSC可能會引起急性猝死，MSC治療可能引起腫瘤，移植物的排異反應，增加某些疾病的易感性等等。本實驗提供了一個新的干細胞治療的策略，我們可以使用干細胞分泌的細胞因子來治療一些相關疾病，這樣可以避免那些干細胞帶來的不良反應及其他并發癥的危險。干細胞治療的使用量是比較大的，而在不影響供體健康的情況下所能提供的細胞數量是有限的，這樣無法避免干細胞在體外擴增，而且代數可能會比較高。這樣問題也隨之而來。隨著體外擴增，干細胞代數的增加，細胞的干性也會隨之減弱［10～12］，治療效果會大打折扣，并且治療風險也會大大增加。應用干細胞分泌的細胞因子來進行相關疾病的治療能夠避免這些風險，，并且解決了干細胞來源少及達到為治療細胞數量而體外擴增引起代數變高的問題，為疾病治療提供了新的減少風險的思路。

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The effect and mechanism of BMMSCs ameliorate on the differentiation function of BMMSCs in ovariectomized rats

ZHANG Li－chao1，3，HE Tao2，3，SHUAI Yi3，CHANG He－ran1，3，DU Xiao－yan1
(1.Dept of Oraland Maxill of Acial Surgery，the Second Affiliated Hospital of Stomatology，Jiamusi University，Jiamusi 154002，China; 2.Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical Collage，Department of Periodontology，Zunyi 563000，China; 3.Tissue Engineering R＆D center，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

Abstract:Objective: To investigate the effect and mechanism of BMMSCs cytokines ameliorate the osteogenesis and adipogenesis of BMMSCs in ovariectomized rats.Methods: Twelve female goats were randomly divided into sham group (sham) and bilateral ovariectomy group (OVX).Sham and OVX model was established.Two months after operation，BMMSCs were extracted and divided into sham (group A)，OVX (group B)，OVX cells and sham culture medium (group C) and sham cells and OVX culture medium (group D).Osteogenesis and adipogenesis of the four groups were examined by alizarin red staining，real－time PCR and western blot.The Wnt canonical passway was examined by western blot.Results: The gene and protein expressions of osteogenesis and the active－β－catenin and p －GSK－3β of Wnt canonical passway: group C was higher than those in group B，and group D was lower than those in group A.The gene and protein expression of adipogenesis: group C was lower than that in group B，and group D was higher than that in group A.Conclusions: BMMSCs cytokines can activate Wnt canonical passway，promote osteogenesis differentiation and inhibit adipogenesis differentiation of BMMSCs in ovariectomized rats.

Key words:osteoporosis; osteogenic differentiation; adipogenic differentiation; Wnt signaling pathway

(收稿日期:2015－04－01)

通訊作者:杜曉巖(1968～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E－mail: duxiaoyan@163.com。

作者簡介:①張立超(1987～)男，黑龍江肇東人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R681

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0093－03