吡非尼酮對UUO大鼠整合素連接激酶表達調控機制①

劉喜鳳，康曉明，丁蘭蘭，李　麗，梅　梅，李慧玲

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內一科，黑龍江佳木斯154003)

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吡非尼酮對UUO大鼠整合素連接激酶表達調控機制①

劉喜鳳，康曉明，丁蘭蘭，李麗，梅梅，李慧玲

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內一科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:探究吡非尼酮(PFD)在單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠中的作用及其對整合素連接激酶(ILK)表達的影響。方法: Wistar雄性大鼠72只，隨機分為3組:正常組、UUO模型組和治療組，每組24只。治療組給予吡非尼酮500mg/kg·d(溶解在1%羥甲基纖維素鈉溶液中)灌胃，正常組和UUO模型組給予等量1%羥甲基纖維素鈉灌胃。各組大鼠在實驗的第3、7、14天分批處死，每次各處死8只，取左腎石蠟包埋，進行HE、Masson染色，同時免疫組化檢測各組大鼠ILK的表達情況。結果:與正常組對應時間點相比，UUO模型組腎小管間質損傷和纖維化程度加重，ILK表達增多，差異有統計學意義(P＜0.05) ;與UUO模型組對應時間點相比，治療組大鼠腎小管間質損傷和纖維化程度減輕，ILK表達減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論:吡非尼酮抑制腎間質纖維化進展，下調ILK表達，推測吡非尼酮改善腎間質纖維化可能與下調ILK的表達有關。

關鍵詞:吡非尼酮;腎間質纖維化;單側輸尿管梗阻; UUO，整合素連接激酶

腎間質纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性腎臟疾病最終的共同途徑［1］，且纖維化的進展與腎功能不全的程度相一致，故尋找一種安全有效治療腎間質纖維化的藥物是預防慢性腎臟病進展的主要方法。吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一種口服的具有抗炎、抗纖維化作用的吡啶酮衍生物，由于其在博來霉素誘導的倉鼠特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)模型中抗纖維化作用的發現，近年來成為抗纖維化研究的熱點。根據國外文獻報道［2～4］，吡非尼酮在多種腎損傷模型中均顯示了抗纖維化作用，并能不同程度改善腎功能，有望成為逆轉或抑制腎間質纖維化的新藥，但確切機制尚不完全清楚。本實驗旨在探究PFD在腎間質纖維化中的作用，以及其對ILK表達的影響。

1　材料與方法

1.1試劑、動物

吡非尼酮(純度＞99%，用1%羥甲基纖維素鈉配制成懸浮液) ;清潔級雄性Wistar大鼠72只，體質量(150±10) g，由佳木斯大學動物實驗中心提供;兔抗大鼠ILK多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，免疫組化試劑盒、DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗步驟

72只雄性Wistar大鼠適應喂養一周后隨機分為3組:正常組(n = 24)、UUO模型組(n = 24)、治療組(n = 24)。UUO模型組、治療組大鼠在無菌條件下行左側輸尿管結扎: 10%水合氯醛0.3～0.4mL/100g腹腔內注射麻醉，常規消毒，大鼠背部左肋腰點下、脊柱左側縱向切開，逐層進腹，暴露腎臟，分離輸尿管，在其近端和遠端分別結扎，中間離斷。慶大霉素生理鹽水沖洗腹腔后，逐層縫合。正常組不做任何處理。治療組給予吡非尼酮500mg/ kg/d灌胃，正常組和UUO模型組以等量1%羥甲基纖維素鈉灌胃，余飲食、水三組正常。各組大鼠在術后第3、7、14天分批處死。處死前收集大鼠24h尿液，處死當天留取靜脈血和左腎組織。腎組織常規脫水、石蠟包埋、切片(厚約3μm)，行HE、Masson染色和免疫組化檢測。

1.2.2生化指標檢測

各組大鼠靜脈血留取后進行尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)檢測，尿液行尿蛋白定量檢測。

1.2.3 HE、Masson染色

石蠟切片分別行HE、Masson染色，分別用來觀察腎小管間質損傷情況和纖維化程度。HE染色切片在200倍光學顯微鏡下觀察10個不同視野(不含腎小球)，參照文獻方法［5］進行腎小管間質損傷評估。Masson染色切片按上述方法選取視野，光鏡下綠染部分為陽性，提示纖維化，利用圖像分析系統計算綠染面積占腎間質(不含腎小管管腔和大血管)面積的比值，評估纖維化程度。

1.2.4免疫組化步驟

石蠟切片在烤箱內烤片15min，溫度設定為60℃。脫蠟至水，期間用0.3%甲醇－過氧化氫處理20min以充分滅活內源性酶。熱抗原修復，5% BSA 37℃孵育20min，滴加1: 100兔抗大鼠ILK多克隆抗體，4℃冰箱過夜。次日恢復室溫后滴加二抗山羊抗兔IgG，37.0℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素輕復染，自來水藍化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察ILK表達情況，視野內表現為棕黃色的顆粒即為陽性染色。每個切片在200倍光鏡下隨機觀察10個不重疊視野(不含腎小球)，利用圖像分析系統計算陽性染色面積占腎間質面積(不含腎小管管腔和大血管)的比值，取平均值。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，所有數據以均數±標準差(±s)的形式表示，組間均數比較應用單因素方差分析，P＜0.05時差異存在統計學意義。

2　結果

2.1生化分析

各組大鼠血BUN、Scr和24h尿蛋白等生化指標無明顯差異。

2.2 HE染色

光鏡下觀察正常組各時間點腎組織結構正常; UUO模型組造模第3、7、14天，腎小管間質損傷逐漸加重，包括不同程度的腎小管擴張、塌陷、管型，腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性、壞死、脫落，間質炎性細胞浸潤，基底膜斷裂等，與對應時間點正常組相比差異存在統計學意義(P＜0.05) ;治療組腎小管間質損傷程度與UUO模型組相比明顯減輕，差異存在統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1　不同時間點三組大鼠腎小管間質損傷評分(±s，n =8)

表1　不同時間點三組大鼠腎小管間質損傷評分(±s，n =8)

注:與對應時間點正常組相比△P＜0.05;與對應時間點UUO模型組相比＊P＜0.05。

組別3d　7d　14d正常組＜0.05　　＜0.05　　＜0.05 0.12±0.03　 0.12±0.03　 0.12±0.04 UUO模型組　1.27±0.36△　2.67±0.86△　4.47±1.21△治療組　0.65±0.13△＊2.10±0.53△＊　3.05±0.98△＊F值　66.38　52.51　60.50 P

2.3 Masson染色

光鏡下觀察可見正常組三個時間點腎組織結構正常，間質基本無綠染; UUO模型組造模后第3、7、14天，染成綠色的膠原纖維逐漸增多，14d時間質基本彌漫性綠染，與正常組對應時間點相比，差異有統計學差異(P＜0.05) ;治療組腎間質綠染的膠原纖維與UUO模型組相比明顯減少，差異存在統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2　不同時間點三組大鼠腎間質纖維化面積比(n =8，%)

2.4 ILK在腎小管上皮細胞的表達情況

正常組腎小管上皮細胞可見極少量ILK陽性表達;與正常組對應時間點相比，UUO模型組腎小管上皮細胞ILK表達增加，且隨時間進展表達逐漸增多，差異有統計學意義(P＜0.05) ;與UUO模型組對應時間點相比，治療組腎小管上皮細胞ILK的表達明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3　不同時間點三組大鼠腎組織ILK表達差異比較(n =8，%)

3　討論

吡非尼酮(PFD)，5－甲基－1－苯基－2(1H)－吡啶酮［6］，是我國唯一獲批的用于治療IPF的1.1類新藥。研究證實PFD是一種細胞因子阻滯劑，通過調節或阻滯多種促纖維化因子，如轉化生長因β(TGF－β)、結締組織生長因子(CTGF)、血小板源生長因子(PDGF)等，抑制成纖維細胞的活化、細胞增殖和細胞外基質的合成;此外還具有抗炎、清除活性氧、抑制脂質過氧化等作用，是廣譜的抗纖維化小分子化合物。多項研究證實，除了IPF，PFD在5/6腎切除腎功能衰竭［2］、抗腎小球基底膜(GBM)腎炎［3］、高血壓腎損傷［4］、等動物模型中，也顯示出良好的抗腎纖維化和改善腎功能作用。例如，Koji Takakura實驗證明吡非尼酮可以降低抗GMB腎炎大鼠尿蛋白的生成; Ji X［4］等研究發現，PFD處理6周可以通過下調高血壓腎損傷大鼠TGF－β/ Smad2/3信號，降低高血壓腎損傷大鼠的血壓和蛋白尿的生成，并且改善腎間質纖維化。綜上所述，PFD具有腎間質纖維化防治研究的良好前景。本試驗建立單側輸尿管梗阻(UUO)腎間質纖維化模型，探究PFD在腎間質纖維化中的抗纖維化作用。腎間質纖維化機制眾多，其中腎小管上皮細胞轉分化(Epithelial－Mesenchymal Transition，EMT)起著關鍵性作用。而參與EMT促進腎間質纖維化的通路中，TGF－β/Smads信號通路至關重要。整合素連接激酶(Integrin－linked kinase，ILK)是1996年Hannigan發現的［7］，是一種獨特的細胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶和銜接蛋白，調節細胞的黏附、生長、侵襲和遷移。研究顯示［8］ILK是TGF－β/Smads信號通路的下游因子，TGF－β依賴細胞內的Smads信號以時間和劑量依賴方式誘導ILK在腎小管上皮細胞表達，共同介導EMT，促進腎間質纖維化。Ji X等已經發現吡非尼酮可以下調TGF－β/Smads信號，改善腎間質纖維化，故我們推測ILK作為TGF－β/Smads下游因子，可能被PFD抑制，達到抗纖維化作用。本試驗以PFD可以抑制TGF－β/Smads信號為前提，探究PFD在UUO大鼠中的抗纖維化作用及對TGF －β/Smads信號通路下游ILK表達影響。實驗通過評估大鼠腎小管間質損傷、纖維化情況，檢測ILK的表達，發現: UUO模型組較正常組腎小管間質損傷和纖維化加重，ILK蛋白表達增多;與UUO模型組相比，治療組腎小管損傷和纖維化減輕，ILK表達減少，提示PFD改善腎間質纖維化，抑制了ILK的表達。

綜上所述，PFD改善了UUO大鼠腎間質纖維化程度，可能與抑制TGF－β/Smads信號通路下游的ILK表達有關。PFD作為廣譜抗纖維化藥物，不僅不良反應少，耐受性好，而且可以改善腎功能，是腎間質纖維化防治的新希望新方向。

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［4］Ji X，Naito Y，Weng H，et al.Renoprotective mechanisms of pirfenidone in hypertension－induced renal injury: through anti－fibrotic and anti－oxidative stress pathways［J］.Biomed Res，2013，34(6) : 309－319

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［6］胡艷秋，于蓮，胡俊華，等.肺靶向吡非尼酮脂質體的制備及體外釋藥性質研究［J］.黑龍江醫藥科學，2012，35(3) : 28－30

［7］趙建輝，何紅權，陳洪宇，等.整合素連接激酶與腎間質纖維化［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2011，12(1) : 88－91

［8］鄭杰，楊亦彬，曾強林，等.TGF－β/Smads/ILK通路與慢性環孢素腎病［J］.遵義醫學院學報，2013，36(4) : 385－387

(收稿日期:2015－12－20)

通訊作者:康曉明(1961～)女，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E－mail: kanglaoshi@163.com。

作者簡介:劉喜鳳(1990～)女，河南焦作人，在讀碩士研究生。

基金項目:①佳木斯大學研究生科技創新項目，編號: LM2015_014。

中圖分類號:R961

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0027－03