Balb/c3T3細胞體外轉化實驗方案的優化①

朱金玲，田　銳，張　虎，張金波，張淑紅，金岳雷，扈清云

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

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Balb/c3T3細胞體外轉化實驗方案的優化①

朱金玲，田銳，張虎，張金波，張淑紅，金岳雷，扈清云

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:優化Balb/c3T3細胞轉化實驗。方法:將不同濃度的血清及改良的培養基分別作用于鼠成纖維細胞Balb/c3T3，選擇不同的時間點，通過細胞形態學觀察和集落實驗，對小鼠成纖維細胞Balb/c3T3的致癌效果的分析。結果:改良的操作程序和培養基，培養的細胞－細胞轉化時間縮短，表現出更強的集落形成能力，顯示出高度的成瘤性。結論:改良的操作程序和培養基的方法可縮短實驗周期，節省人、財、物力。

關鍵詞:Balb/c3T3細胞;細胞轉化;細胞集落實驗; ITES

腫瘤已成為嚴重威脅人類生命與健康的疾病，大多數腫瘤是由環境致癌物引起的。20世紀60年代以來，體外細胞培養技術的發展成熟，人們開始用離體培養細胞對環境污染物進行毒性評價［1，2］。體外檢測技術是近年來逐漸發展和成熟起來的一種有效的篩選和檢測環境污染物的方法，主要包括染色體畸變試驗－微核試驗、DNA損傷檢測－單細胞凝膠電泳技術(即彗星試驗)、體外細胞轉化試驗等［3］，其中體外哺乳動物細胞轉化試驗已被國際癌癥研究中心、歐洲替代方法研究中心、全國危險化學品管理標準化技術委員會等眾多機構評價為一種有效的篩選致癌物的方法［3～6］。體外哺乳動物細胞轉化試驗是利用動物細胞在體外培養的環境下，模擬致癌物在體內致瘤的作用進行致癌物檢測的一種技術。目前唯一直接評價致癌物毒性的體外試驗方法是體外細胞轉化試驗，該方法通過對模型細胞染毒，使正常細胞啟動轉化后，進入促長階段，經五周以上的培養，通過顯微鏡觀察細胞形態，計算轉化克隆數，改方法實驗周期長，轉化頻率低，實驗成本較高。為此，為縮短檢測時間，提高環境致癌物的檢測效率，降低成本，我們對Balb/c3T3細胞體外轉化實驗方案進行了優化，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞

小鼠胚胎成纖維細胞BALB/3T3 clone A31，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清，Gibco公司;葡萄糖、HEPES，天津市科密歐化學試劑有限公司，N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(N－me thy－lN－nitro －N－n itrosoguan id ine，MNNG)、佛波酯(12－O －tetradecanoy－l phorbo－l 13－ace tate，TPA)、 DMSO、ITES，Sigma公司;低熔點瓊脂糖，Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉化實驗

實驗分為8組，第1組是TPA處理組:將細胞以1X104/皿接種于直徑為6cm平皿中，每個處理組平行接種3皿，37℃，5%CO2濕箱中培養，DMEM培養基血清濃度為10%，培養24h后加入N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(MNNG) 1μg/mL，4h后換培養基除去MNNG，繼續培養7d，于接種后第8天加入濃度為0.1μg /mL的TPA繼續培養，每周換液2次，同時補加TPA，第22天除去TPA，第27天甲醇固定細胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態及轉化灶。第2組是MNNG對照組:用0.2%的DMSO代替TPA，第3組是DMSO對照組:用DMSO代替MNNG和TPA，其他方法同TPA處理組。第4組是正常完全培養基DMEM組:不加任何藥品。第5～8組按照1～4組處理，不同的是每組在第8天添加的是改良的DMEM培養基，其含有1%ITES(含胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉4種因子)和含2%的胎牛血清，且第14天除去TPA，第19天甲醇固定細胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態及轉化灶。

1.2.2軟瓊脂集落實驗

對以上8組細胞培養結束時，制成500個活細胞/mL的細胞懸液。取1mL已融化1.2%低熔點瓊脂置于6孔板中，作為底層瓊脂，然后取0.5mL細胞懸液分別加入已融化0.7%低熔點瓊脂0.5mL中混勻。然后移入6孔培養板，置5% CO2培養箱中，37℃進行培養7～10d，利用倒置顯微鏡進行觀察。可見的細胞團(含50個以上細胞)作為計數集落的標準。

1.2.3轉化結果判定方法

體外細胞轉化試驗是以細胞形態惡性轉化為檢測終點。對轉化細胞的判定通常采用細胞灶法，計數克隆數，觀察鑒定轉化灶，單盲法觀察，由2人共同認定。轉化灶的判定標準:正常細胞灶，灶內細胞排列規則，束狀，細胞灶外圍區的細胞單層生長，規則。轉化細胞灶，灶內細胞由正常的長梭形變為短梭狀，失去接觸抑制，呈復層生長，排列紊亂，形成交叉和旋渦。吉姆薩染色惡性轉化灶細胞嗜堿深染，致密多層，自由定向生長。

2　結果

2.1細胞轉化的形態學及轉化灶的吉姆薩染色觀察

細胞邊緣可見光亮狀，細胞排列雜亂無序，周圍細胞呈明顯的放射狀分布;加入含ITES培養基培養后細胞生長速度與未添加組分對比明顯升高，且細胞周圍接觸抑制均無，細胞雜亂無序重疊生長，可見典型的形態轉化灶。

圖1　上組圖為27d各組的細胞形態，下組圖為第19天各組的細胞形態

如圖1所示，正常轉化組與改良培養基轉化組比較，ITES組總體轉化效率提高，轉化時間縮短，且加入ITES的MNNG－TPA組惡性程度極高。

2.2軟瓊脂集落實驗

除MNNG－TPA組外其余組的細胞表現出非惡性及非侵襲性特點，在軟瓊脂細胞集落形成實驗中顯示出無或極少數細胞集落形成。而MNNG－TPA組有部分細胞集落出現，而含ITES培養基培養的MNNG－TPA組細胞表現出高于正常培養基培養的MNNG－TPA組細胞的細胞集落形成率。所有含ITES培養基培養的MNNG－TPA組細胞均顯示出更強的集落形成能力，顯示出高度的成瘤性。

3　討論

1985年IARC對以BALB c 3T3細胞為基礎的細胞轉化方法進行了系統的評估，提出了細胞轉化實驗標準方法，該方法雖能有效檢測環境致癌物，但是存在著實驗周期長、轉化頻率低，實驗成本較高等不足［8］。為縮短檢測時間，提高環境致癌物的檢測效率，降低成本，我們對Balb/c3T3細胞體外轉化實驗方案進行了優化，對操作程序和培養基進行了改進，將培養基加入1%ITES(含胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉4種因子)。在各期的形態學觀察中我們發現:接種初期細胞死亡比較明顯，在第一次加入MNNG后細胞開始出現大量死亡或貼壁不牢固的現象，7d后加入TPA以后細胞開始出現第二次大量死亡，14d后，細胞開始大量增值，死亡數量明顯減少。但加入ITES培養后細胞數量MNNGTPA組細胞數量大于不加ITES組，其余均少于不加ITES組。

正常未加入藥品的組，細胞貼壁狀態好，細胞呈長梭形，胞質清透，死亡率低;加入含ITES培養基培養后細胞生長速度緩慢，細胞貼壁效果不好細胞死亡數量較大。陰性對照DMSO組中，細胞生長受到抑制，生長速度與正常組對比緩慢，且有部分細胞死亡貼壁狀態較正常組差，但少部分細胞落中間細胞呈方形，胞質均勻，細胞核略變大，且細胞周圍呈圓亮;加入含ITES培養基培養后細胞生長速度、貼壁效果與DMSO組分基本一致，但死亡細胞數量明顯增多。MNNG－DMSO組中，細胞生長受到的抑制不明顯，細胞貼壁狀態較對照DMSO組差，但細胞死亡數量明顯減少，大部分細胞集落中間細胞呈方形，胞質不均勻，細胞核變大，且細胞周圍呈圓亮。MNNG－TPA組中細胞生長速度最快，細胞團中間細胞間接觸抑制消失，胞質渾濁，細胞核變大，常見雙核細胞。經染色后觀察，正常組細胞、陰性對照DMSO組、陰性對照MNNG－DMSO組，細胞均存在接觸抑制，細胞生長呈長梭形，細胞單層生長，胞漿

和核染色較淺。而MNNG－TPA組細胞接觸抑制現象消失，細胞呈不規則形狀，細胞多層重疊生長，胞漿淡染，細胞核深染，且細胞呈侵襲生長。轉化灶呈放射狀生長，邊緣不整齊，符合Ⅲ型轉化灶的特征［7］。

結果顯示ITES可使轉化頻率提高，同時轉化灶出現時間提前，同時我們調整降低DMEM培養基中的胎牛血清(FCS)濃度，最低調整到2%，實驗結果與傳統采用10%FCS的DMEM培養的方法相比，調整后的方法可將轉化實驗周期縮短至3周，且較低的血清濃度可以降低血清批次差別對轉化實驗重現性的影響。結果表明使用DMEM + 2% FCS + 1% ITES培養的效果最好，實用可行，節省了人、財、力。后續我們將用該方法檢測毒物驗證其效果。

參考文獻:

［1］Dimitrov S D，Mekenyan O G，Sinks G D，et al.Global modeling of narcotic chemicals: ciliate and fish toxicity［J］.Journal of Molecular Structure: Theochem，2003，622(1－2) : 63－70

［2］李磊，楊雨晗，王雙，等.細胞活性檢測方法之比較［J］.生物學雜志，2011，28(1) : 87－93

［3］BOLEY S E，MCMANUS T P，MAHER V M，et al.Malignant transformation of human fibroblast cell strain MSU－1 1 by NMethyl－N－nitrosourea: Evidence of eliminationof p53 by homologous recombination［J］.Cancer Res，2000，60(15) : 4105－4111

［4］Vanparys P，Corvi R，Aardema M，et al.ECVAM prevalidation of three cell transformation assays［J］.Altex，2010，28: 56－59

［5］Sakai A，Sasaki K，Hayashi K，et al.An international validation study of a Bhas 42 cell transformation assay for the prediction of chemical carcinogenicity［J］.Mutat Res，2011，725(1－2) : 57

［6］Stuart Creton，Marilyn J，Aardema1，et al.Cell transformation assays for prediction of carcinogenic potential: state of thescience and future research needs［J］.Mutagenesis，2012，27: 93－101

［7］Tsuchiyat，Umedam.Improvement in the efficiency of the in vitro transformation assay method using BALB 3T3 A31－1－1 cells［J］.Carcinogensis，1995，16(8) : 1887－1894

［8］張磊，曾毅.Balb/c3T3細胞體外轉化實驗及其在環境致癌物檢測上的應用［J］.衛生研究，2009，38(2) : 226－231

(收稿日期:2015－12－18)

通訊作者:扈清云(1967～)男，黑龍江綏化人，碩士，教授，碩士研究生導師。E－mail: 370786436@ qq.com。

作者簡介:朱金玲(1967～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。

基金項目:①1.黑龍江省自然科學基金資助，編號: H201369; 2.佳木斯大學科學技術研究重點項目，編號: Sz2013－001。

中圖分類號:R979.1

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0001－02