標記引物數量對白樺遺傳多樣性的影響

趙雙菁,劉瑩瑩,魏敏靜,楊傳平,魏志剛

〔林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)，黑龍江 哈爾濱 150040〕

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標記引物數量對白樺遺傳多樣性的影響

趙雙菁,劉瑩瑩,魏敏靜,楊傳平,魏志剛

〔林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)，黑龍江 哈爾濱 150040〕

摘要以帽兒山實驗林場15個種源的白樺種源試驗林300個樣本為試驗材料，通過不同數量的SRAP引物對白樺遺傳多樣性研究結果的影響做出分析，并提出標記引物確定的計算公式。結果表明，SRAP引物數量不影響白樺各種源間遺傳參數的變化趨勢，但隨著引物數量的增加，區分不同種源間遺傳差異的能力隨之提高，當SRAP引物數量為15對時，可探測到的多態位點百分率達98.5%以上。

關鍵詞白樺;標記引物數量;遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎和核心，是生態系統多樣性和物種多樣性的基礎方面，保護生物多樣性最終是要保護其遺傳多樣性[1]。林木遺傳多樣性的研究開始于形態學為基礎的種源試驗，如杉木(Cunninghamialanceolata)、桉樹(Eucalyptusrobusta)、紅松(Pinuskoraiensis)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)和長白落葉松(Larixolgensis)等樹種的種源試驗研究[2，3]。同工酶標記發明后，被先后運用到歐洲赤松(Pinussylvestris)、云杉(Piceaasperata)、紅松、顫楊(Populustremuloide)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)等重要林木遺傳多樣性研究中[4-6]。隨后，DNA標記的出現及其技術自身的優點，被迅速運用到林木遺傳多樣性研究中并極大地推動了該領域的研究進程，如歐洲赤松、栲樹(Castanopsisfargesii)、挪威云杉(Piceaabies)、山毛櫸、歐洲刺槐(Robiniapseudoacacia)、云杉、海岸松(Pinuspinaster)、雪松(Cedrusdeodara)、紅松、木荷(Schimasuperba)、長葉榧(Torreyajackii)和白皮松(Pinusbungeana)等一些主要用材和珍稀瀕危樹種均采用DNA標記進行了研究，是林木遺傳多樣性研究中應用最廣泛的技術[7]。目前為止，雖然大規模測序技術的不斷發展和完善，相繼有楊樹、桉樹和歐洲赤松等少數幾個樹種完成了全基因測序，這為基于SNP技術為基礎的林木遺傳多樣性及輔助選擇育種提供了可能，然而對于多數植物與樹木而言仍然缺乏全基因組序列，因此，目前基于基因組非編碼區變異變為基礎的DNA標記技術仍是多數植物遺傳多樣性研究中的主要方法與技術。

群體遺傳學的研究基礎是DNA序列變異。同源DNA序列的遺傳分化程度是衡量群體遺傳結構的主要指標，其分化式樣則是理解群體遺傳結構產生和維持的進化內在驅動力諸如遺傳突變、重組、基因轉換的前提[8]。因此，在遺傳多樣性研究中，要盡可能地揭示出該物種全基因組區域的DNA序列的變異，這樣才能全面反映出其遺傳多樣性和群體遺傳結構，為后期資源的保存和利用奠定基礎。DNA分子標記，不同的標記及引物反映的基因組區域的不同DNA序列變異，因此如果標記數量較少時，可能無法全部覆蓋基因組上產生變異的所有區域，因此不可能揭示該變異的全部信息[9]，而數量過多，不能增加信息量還會造成額外的實驗成本。因此，對于遺傳多樣性研究中，究竟采用多少標記足以揭示其群體的遺傳結構是一個值得重視的問題。如Julio等在研究薔薇的遺傳多樣性時發現，對于雜合度的估算，必須有10個以上的個體和20個以上的標記[10]。而Reyazu等在黃麻(Corchorusspecies)遺傳多樣性研究中發現，15對與41對SSRs引物揭示的信息量相同[11]。白樺(Betulaplatyphylla)是一種分布范圍廣、適用性強、用途廣泛的闊葉速生樹種，然而，有關白樺遺傳多樣性研究報道中 ，同樣也沒有重視到標記數量對遺傳參數結果與遺傳結果影響的問題。

SRAP ( Sequence-related amplified polymorphism，序列相關擴增多態性) 標記建立以來，由于其操作簡便快速、成本低、可信度高、易于測序等特點備受分子生物學家的青睞[9]，被迅速應用到蓮藕(Nelumbonucif)[10]、桃(Amygdaluspersica)[11]花生(Arachishypogaea)[12]、油菜(Brassicanapus)[13]、黃瓜(Cucumissativus)[14]、甘薯(Dioscoreaesculenta)[15]和西瓜(Citrulluslanatus)[16]等植物的種質資源鑒定評價、遺傳圖譜構建(包括轉錄圖譜)、重要性狀標記乃至基因分離克隆等方面得到了應用。本文通過對不同SRAP引物對白樺遺傳多樣性研究結果的影響的研究，提出SRAP標記研究白樺遺傳多樣性引物數量的標記，在此基礎上提出標記引物確定的計算公式。

1材料與方法

1.1試驗材料來源

試驗材料來自東北林業大學帽兒山實驗林場白樺種源試驗林，共15個種源，分別為：新疆、涼水、汪清、露水河、小北湖、輝南、桓仁、草河口、綽爾、寧夏、莫爾道嘎、清源、東方紅、帽兒山、烏伊嶺。每個種源隨機選取20個個體，共計300個樣本。2012年6月采取當年生嫩葉，用密封袋封好，做好標記，放在冰盒中帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2試驗方法

1.2.1白樺葉片基因組DNA提取白樺葉片基因組DNA提取方法見參考文獻[12]。

1.2.2反應體系及反應程序SRAP該反應體系為20 μL：0.21×106μgL-1DNA，1.5 μL；25 mmolL-1Mg2+，1.4 μL；5 UμL-1Taq酶，0.25 μL；2.5 mmolL-1dNTPs，2 μL；10 μmL-1引物，0.35 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸7 min[13，14]。

1.2.3引物篩選本研究中所用SRAP引物根據文獻[15]中的引物序列，在上海生工合成。從15個種源中選取地理位置最近的2個種源(莫爾道嘎和桓仁)，每個種源選5個個體用于引物的篩選。以條帶清晰并且群體與個體間至少有一條差異條帶的引物為選擇標準，從合成的30對引物中，篩選出17對條帶清晰、多態性高的引物用于實驗分析。引物序列如表1所示。

表1　SRAP引物序列

1.2.4SRAP引物數量按5、7、9、11、13、15、17對SRAP引物對15個白樺種源進行擴增和分析。

1.3數據統計及分析

電泳圖譜中的每一條帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結合位點，可記為一個分子標記，根據分子量標準對照反應產物在膠上的對應位置，估計擴增產物的分子量大小，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”[16]。所得結果為一二元數據矩陣，利用Popgene32軟件計算各項遺傳參數。

2結果與分析

2.1不同標記引物數量的白樺群體遺傳多樣性

按5、7、9、11、13、15、17對SRAP引物對15個白樺種源、300個個體進行SRAP擴增并對各遺傳參數統計分析，結果見表2。表2表明，引物數量不同時，得到的白樺群體遺傳多樣性各項參數的大小也不同。如5對特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8)共檢測到46個位點，其中多態位點有45，多態位點百分率達97.83%，多態位點數量為21～33、多態位點百分率在45.65%～71.74%，平均等位基因數在1.456 5～1.717 4，有效等位基因數在1.200 8～1.333 9，Nei’s指數在0.123 1～0.202 6，Shannon指數在0.192 6～0.314 1，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，最小為草河口種源。白樺種源總基因多樣性為0.234 3，種群內基因多樣性為0.168 2，種群間的遺傳多樣性為0.066 1，種源間分化系數為0.283 0，說明71.70%的遺傳變異存在于種源內，28.30%存在于種源間，基因流Nm為 1.272 8。

7對SRAP引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3)共檢測到62個位點，其中多態位點有61，多態位點百分率為98.38%，多態位點數量在26～61之間、多態位點百分率在41.94%～98.38%，平均等位基因數在1.419 4～1.709 7，有效等位基因數在1.205 8～1.295 3、Nei’s指數在0.125 2～0.214 1、Shannon指數在0.193 1～0.320 6，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大與最小種源分別為涼水和淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.243 7，種群內和種群間基因多樣性為0.166 1和0.077 6，種源間分化系數為0.318 3，說明68.16%的遺傳變異存在于種源內，31.84%存在于種源間，基因流Nm為1.070 6。

9對SRAP引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9)檢測到白樺各種源平均等位基因數為1.369 9～1.726 0，有效等位基因數1.176 3～1.373 9，Nei’s指數在0.107 6～0.216 4，Shannon指數在0.166 8～0.325 3，多態位點數量為27～72、多態位點百分率達36.99%～98.63%，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.248 8，種群內基因多樣性Hs為0.163 8，種群間的遺傳多樣性為0.077 6，種源間分化系數為0.341 9，說明65.84%的遺傳變異存在于種源內，34.16%存在于種源間，基因流Nm為0.962 5。

11對特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4)檢測到白樺各種源平均等位基因數為1.348 3～1.752 8，有效等位基因數為1.165 8～1.367 2，Nei’s指數為0.101 3～0.223 4，Shannon指數為0.157 1～0.344 2，多態位點數量為31～87，多態位點百分率為34.8%～75.68%，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.248 1，種群內基因多樣性為0.162 9，種群間的遺傳多樣性為0.085 2，種源間分化系數為0.343 5，說明65.66%的遺傳變異存在于種源內，34.34%存在于種源間，基因流Nm為0.955 7。

13對特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4、me5em11、me6em12) 檢測到白樺各種源平均等位基因數為1.403 8～1.769 2，有效等位基因數1.191 3～1.379 0，Nei’s指數在0.118 5～0.229 1，Shannon指數0.184 0～0.352 0，多態位點數量為42～80，多態位點百分率達40.38%～76.92%，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.255 6，種群內基因多樣性為0.168 4，種群間的遺傳多樣性為0.087 2，種源間分化系數為0.341 1，說明65.88%的遺傳變異存在于種源內，34.12%存在于種源間，但基因流Nm為0.966 0。

15對特異性引物(me2em3、me2em4、me2em5、me2em6、me2em8、me2em11、me3em3、me3em4、me4em9、me4em11、me5em4、me5em11、me6em12)檢測到白樺各種源平均等位基因數為1.408 3～1.791 7，有效等位基因數為1.211 6～1.396 4，Nei’s指數為0.125 3～0.239 3，Shannon指數為0.190 9～0.367 0，多態位點數量為42～80，多態位點百分率為40.38%～76.92%，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，而最小為淖爾種源。白樺種源總基因多樣性為0.262 3，種群內基因多樣性Hs為0.173 0，種群間的遺傳多樣性為0.089 3，種源間分化系數為0.340 6，說明65.96%的遺傳變異存在于種源內，34.05%存在于種源間，但基因流Nm為0.967 9。

利用篩選出的17對特異性SRAP引物檢測到白樺各種源平均等位基因數為1.363 0～1.829 6,有效等位基因數為1.188 1～1.415 3，Nei’s指數為0.111 4～0.248 3，Shannon指數為0.169 7～0.379 9，多態位點數量為49～112，多態位點百分率為36.3%～82.96%，各種源上述遺傳參數的變化趨勢基本一致，最大均為涼水種源，最小為清源種源。白樺種源總基因多樣性為0.2591，種群內基因多樣性為0.170 7，種群間的遺傳多樣性為0.088 4，種源間分化系數為0.340 9，說明65.88%的遺傳變異存在于種源內，34.12%存在于種源間，基因流Nm為0.966 5。

表2　不同引物數量遺傳參數比較

注：a為引物數量為5對時白樺種源的聚類結果，b為引物數量7對時白樺種源的聚類結果，c為引物數量9對時白樺種源的聚類結果，d為引物數量11對時白樺種源的聚類結果，e為引物數量13對時白樺種源的聚類結果，f為引物數量15對時白樺種源的聚類結果，g為引物數量17對時白樺種源的聚類結果

2.2白樺種源不同樣本數量時群體間親緣關系

為了進一步分析引物數量對于群體遺傳結構的分析結果的影響，對不同標記數量分析了白樺15個種源間的遺傳距離并進行了聚類分析。結果表明，引物數量不同，不僅對不同種源間的遺傳距離的估算結果產生影響，而且得到的白樺種源間進化關系存在一定的差異(圖1)。不同引物數量，反映出遺傳距離最近與最遠的種源也存在差異，如當引物數為7、13、15和17對時，遺傳距離最小的2個種源均為莫爾道嘎和桓仁；而引物數為5、9和11對時，遺傳距離最小的2個種源為清源和寧夏。引物數量為9、11、13、15和17對時，遺傳距離最大的2個種源均為涼水和草河口，而引物數量為7對時，涼水和東方紅種源的遺傳距離最大；引物數量為5對時，涼水和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。從上述不同引物數量白樺種源聚類結果來看，在相同的遺傳距離處(如0.11處)，不同引物數量導致白樺種源聚類類群數量各不相同，如當引物數量為5對時，15個種源聚成3類；當引物數量為5對時，15個種源聚成3大類群；引物數量為7和9對時，聚成4類。同時，上述不同聚類結果中，包含的種源也各不相同，總體來說，隨著引物數的增多，聚類數量與每個類別中包括的種源趨于相同。如當引物數量為5對時， 15個種源可聚成3個類群：涼水種源聚為一類，烏伊嶺聚為一類，其余種源聚成一大類(圖1 a)。當引物數量為7對時，可聚成4個類群：涼水種源聚為一類，輝南聚為一類，汪清、新疆、露水河聚成一類,其余種源聚成一大類(圖1 b)。當引物數量為9對時，可聚成4個類群：涼水種源聚為一類，輝南聚為一類，汪清、新疆、露水河聚成一類，其余種源聚成一大類(圖1 c)。當引物數量為11對時，可聚成5個類群：涼水種源單獨聚為一類；汪清、新疆、露水河種源聚為一類；小北湖、桓仁、莫爾道嘎、輝南聚為一類；草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類，東方紅、烏伊嶺、帽兒山種源聚為一類(圖1d)。當引物數量為13對時，可聚成5個類群：涼水、汪清種源聚為一類，新疆、露水河種源聚為一類，小北湖、輝南、莫爾道嘎和桓仁種源聚為一類，草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(圖1 e)。當引物數量為15對時，可聚成6個類群：涼水、汪清種源聚為一類；新疆、露水河種源聚為一類，桓仁為一類、東方紅、烏伊嶺、帽兒山聚為一類，小北湖、輝南、莫爾道嘎種源聚為一類，草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類(圖1 f)。當引物數量為17對時，可聚成5個類群：涼水、汪清種源聚為一類；新疆、露水河種源聚為一類；小北湖、輝南、桓仁、莫爾道嘎種源聚為一類；草河口、淖爾、寧夏、清源種源聚為一類；東方紅、烏伊嶺、帽兒山聚為一類(圖1 g)。

2.3引物數量和白樺遺傳參數的相關分析

為了進一步弄清SRAP引物數量對白樺主要遺傳參數影響的大小，對引物數量和各遺傳參數進行了相關性分析(表3)，結果表明，引物數量白樺群體的有效等位基因數量Ne、Nei’s基因多樣性指數H、Shannon’s信息多樣性指數I、多態位點、多態位點百分率和群體基因多樣性間呈極顯著相關，而群體間分化系數與基因流與引物數量之間顯著相關，而與其他遺傳參數之間無顯著相關。

表3　SRAP引物數量與主要遺傳參數的相關性

注：表格內上面數字為相關系數，下面為顯著性水平

2.4白樺遺傳多樣性引物數量的確定

在群體遺傳多樣性研究中，檢測多態位點數越高越有利于分析和研究群體遺傳多樣性和遺傳結構，因此對白樺種源不同樣本數量與多態位點百分率進行擬合分析(圖2)，在95%的置信區間內，兩者之間極顯著線性回歸，其決定系數為93.9%，表明兩者之間存在較好的相關性。

我們在白樺遺傳多樣性研究時，可在綜合考慮成本、技術難度等基礎上，根據所需多態位點百分率大小，計算出所需樣本的數量。如當白樺遺傳多樣性研究時，以最低所需多態位點百分率98.5%為標準，則每個種源所需引物數量為14、16對時，實際操作中可設為15對標記。

3結論

3.1SRAP引物數量對白樺種源遺傳參數影響不同。其中，引物數量與白樺群體的有效等位基因數量、Nei’s基因多樣性指數、Shannon’s信息多樣性指數I、多態位點、多態位點百分率和群體基因多樣性間呈極顯著相關，而群體間分化系數與基因流與引物數量之間顯著相關，而與其他遺傳參數之間無顯著相關。不同標記數量與存在顯著差異的遺傳參數之間均呈正相關，然而，除5個SARP標記數時，15個白樺種源內多態位百分率最低為草河口種源，而7個標記以上時，分析發現多態位百分率最低均為淖爾種源。

除此之外，不同標記數量反映出的白樺不同種源間各遺傳參數的變化趨勢基本相似，表明不同引物數量并不影響白樺各種源間遺傳參數的變化趨勢。

3.2SRAP不同引物數量對白樺15個種源間進化關系的分析結果有較大影響。當引物數量分別為5和7時，反映出的遺傳距離最小與最大的種源均不同，當引物數量為9和11對時，反映出的遺傳距離最小種源不同，但遺傳距離最大的2個種源相同，均為涼水和草河口；引物數量超過13對時，種源間遺傳距離最小與最大的2對種源分別為莫爾道嘎和桓仁、涼水和草河口。而且，隨著SRAP引物數量增加，在遺傳距離為0.11處，分別可將15個種源聚類成3、4、4、5、6、5和5個類別，表明隨著引物數量的增加，區分不同種源間遺傳差異的能力總體上也隨之提高。

3.3SRAP引物數量與其多態位點百分率呈線性相關，且決定系數達93.9%。并以此為公式計算出開展白樺遺傳多樣性研究時，如設定要探測到的多態位點百分率達98.5%以上時，白樺遺傳多樣性研究中SRAP引物數量設定為15個。

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Effects of Number of Labeling Primers on Genetic Diversity ofBetulaplatyphylla

Zhao Shuangjing, Liu Yingying, Wei Minjing, Yang Chuanping, Wei Zhigang

〔State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin 150040,China〕

AbstractTaking 300 samples from 15 provenance in experimental forest farm for Betula platyphylla in Maoershan Experimental Forest Farm as experimental materials,the effects of different number of SRAP on primers genetic diversity of Betula platyphylla were analyzed. The formula for labeling primers was proposed. Result shows that the number of SRAP primer does not affect the trends for genetic parameters among provenances of Betula platyphylla. The ability of distinguishing genetic differences among different provenances increase with the increase of the number for labeling primers. While SRAP primer number being 15 pairs,polymorphic percentage which can be detected reach above 98.5%.

Key wordsBetula platyphylla;number of labeling primers;genetic diversity

中圖分類號：S792.153

文獻標識碼：A

doi:10.13601/j.issn.1005-5215.2016.04.002

作者簡介：趙雙菁，碩士，Email:zshuangjing2006@163.com通訊作者：魏志剛，教授，博士，Email:zhigangwei1973@163.com

基金項目：863課題白樺、桉樹等分子育種與品質創制(2011AA100202)

收稿日期：2016-03-21

文章編號：1005-5215(2016)04-0006-05