鋁脅迫下胡枝子根尖胼胝質(zhì)形成規(guī)律及影響因素

孫清斌，沈仁芳，尹春芹，趙學(xué)強(qiáng)中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京　0008湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，黃石　435003

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鋁脅迫下胡枝子根尖胼胝質(zhì)形成規(guī)律及影響因素

孫清斌1，2，沈仁芳1，*，尹春芹2，趙學(xué)強(qiáng)1
1中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008
2湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，黃石435003

摘要:采用水培試驗(yàn)，研究了鋁脅迫下兩個(gè)胡枝子品種根尖產(chǎn)生胼胝質(zhì)的變化規(guī)律及影響因素。結(jié)果表明，兩個(gè)品種的根尖鋁吸收量與胼胝質(zhì)形成量呈正比例關(guān)系。品種間差異主要是在根尖0—0.5 cm處。敏感品種胼胝質(zhì)形成量同鋁吸收量的變化趨勢(shì)相一致，而耐性品種則在鋁處理6 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)高峰值后下降。去除鋁脅迫后，耐性品種胼胝質(zhì)形成量并不顯著減少。與單獨(dú)鋁處理相比，陰離子通道抑制劑苯甲酰甲醛加鋁處理對(duì)兩個(gè)品種胼胝質(zhì)形成無(wú)影響;尼氟滅酸加鋁處理抑制敏感品種胼胝質(zhì)的形成，對(duì)耐性品種無(wú)影響;蒽-9-羧酸加鋁處理顯著抑制兩個(gè)品種的胼胝質(zhì)形成。另外，抑制劑2-去氧-D-葡萄糖加鋁共同處理與單獨(dú)鋁處理相比，敏感品種的胼胝質(zhì)形成量顯著降低，耐性品種無(wú)影響。甘露醇對(duì)兩個(gè)品種胼胝質(zhì)形成的影響無(wú)顯著差別。鑭處理下胼胝質(zhì)的形成量是耐性品種顯著高于敏感品種，鋁、鑭同時(shí)處理胼胝質(zhì)的形成量最高。敏感品種胼胝質(zhì)形成處理間無(wú)差別。總之，耐性品種在鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成與有機(jī)酸分泌可能存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系;鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成是敏感指標(biāo);在一定條件下，特別是有機(jī)酸分泌前胼胝質(zhì)的形成可能具有一定抗性意義;鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成受多種外界因素(濃度、時(shí)間、有機(jī)酸分泌，滲透壓等)的影響。

關(guān)鍵詞:胡枝子;鋁脅迫;胼胝質(zhì);有機(jī)酸

孫清斌，沈仁芳，尹春芹，趙學(xué)強(qiáng).鋁脅迫下胡枝子根尖胼胝質(zhì)形成規(guī)律及影響因素.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36(4):1073-1082.

Sun Q B，Shen R F，Yin C Q，Zhao X Q.Analysis of variations in and factors affecting callose formation in response to al stress in Lespedeza Root Tips.Acta Ecologica Sinica，2016，36(4):1073-1082.

酸性土壤中鋁毒害是限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的最主要影響因子之一［1］。到目前為止，鋁脅迫下對(duì)質(zhì)外體和共質(zhì)體所造成的毒害被認(rèn)為是澄清鋁毒害機(jī)制中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［2］。盡管共質(zhì)體的作用不容忽視，但質(zhì)外體的保護(hù)作用卻是植物具備耐鋁性的前提條件［1］。這是因?yàn)楸M管質(zhì)外體在地上器官和根皮層的組織體積中僅占5%或更少［3］，但其結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸特性決定了其在水分、養(yǎng)分和生長(zhǎng)物質(zhì)(激素)運(yùn)輸上起著重要作用［4］。多位專(zhuān)家認(rèn)為，植物的質(zhì)外體具備調(diào)控植物鋁毒害的能力［5-7］。因此，研究鋁脅迫下質(zhì)外體反應(yīng)，探索其與鋁脅迫之間的關(guān)系有著一定的理論意義。

鋁毒害下植物最快的反應(yīng)之一是胼胝質(zhì)迅速在質(zhì)外體部位合成和沉淀，這一生理反應(yīng)可以在數(shù)分鐘內(nèi)檢測(cè)到［2，8］。高等植物原生質(zhì)膜上包含葡聚糖合酶，用于纖維素和胼胝質(zhì)的合成［9］，其中纖維素合酶和胼胝質(zhì)合酶復(fù)合體構(gòu)成了原生質(zhì)膜上的第二大蛋白家族，這一聚合體存在于原生質(zhì)膜的外表面，致力于調(diào)控纖維素和胼胝質(zhì)的合成［10］。植物在遇到機(jī)械傷害、生理逆境或病菌感染時(shí)胼胝質(zhì)合酶會(huì)大量合成胼胝質(zhì)［11-13］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥胼胝質(zhì)合酶(GSL)家族包含12個(gè)成員(GSL1-GSL12)［14］，根據(jù)其在植物體內(nèi)的功能可分兩組［15］:較大組(包括GSL1，GSL2，GSL6，GSL8，GSL10)的作用是在花粉形成和細(xì)胞分裂過(guò)程中合成胼胝質(zhì);較小組(包括GSL5，GSL7，GSL12)的作用是逆境條件下形成胼胝質(zhì)，以加強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的抗逆性，其中GSL5對(duì)于胼胝質(zhì)形成起至關(guān)重要的作用［16］;其它基因片段功能尚不清楚。另外，這些基因片段具體的生物反應(yīng)過(guò)程和定位至今尚未鑒定出來(lái)。到目前為止，支持植物合成胼胝質(zhì)起到調(diào)節(jié)作用的直接有力證據(jù)主要集中在花粉壁形成［15］和病害誘導(dǎo)［13，17］胼胝質(zhì)形成方面。而對(duì)于除擬南芥之外植物以及其它生物逆境條件下胼胝質(zhì)產(chǎn)生的生物化學(xué)機(jī)制、與信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系等研究尚且不足。

另一方面，鋁脅迫誘導(dǎo)胼胝質(zhì)合成是植物鋁敏感性指標(biāo)，可作為區(qū)分不同植物或品種間耐鋁性差別的可靠參數(shù)［18-22］。同時(shí)，胼胝質(zhì)形成可能在調(diào)節(jié)鋁毒害上有一定的積極意義。鋁脅迫下高等植物胼胝質(zhì)的聚集被認(rèn)為是阻礙或減少鋁進(jìn)一步貫穿質(zhì)外體的屏障［23］。Sivaguru等證明，鋁脅迫下在胞間連絲上形成胼胝質(zhì)可以有效地阻礙細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞，從而最大可能地降低鋁脅迫造成的影響［24］。Eticha等也認(rèn)為，鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成量提高是不同玉米品種更好地適應(yīng)酸性土壤上生長(zhǎng)的一種有效方式，纖維素和胼胝質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的差異可能是調(diào)節(jié)它們功能的關(guān)鍵所在［21］。Buchanan等指出，不同于纖維素(1，4-β-D-葡聚糖)彼此之間平行排列的結(jié)構(gòu)，胼胝質(zhì)(1，3-β-D-葡聚糖)可以形成二級(jí)或三級(jí)螺旋的空間結(jié)構(gòu)［10］。然而鋁脅迫下誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成是否具有抗性意義至今尚無(wú)明確定論。

胡枝子作為酸性土壤上的先鋒植物，其耐鋁能力毋庸置疑。目前已知其耐性品種主要通過(guò)分泌有機(jī)酸、高效利用磷以應(yīng)對(duì)鋁脅迫［25-26］。鑒于胼胝質(zhì)形成是植物受到鋁脅迫后最為迅速的反應(yīng)之一，其形成也是植物對(duì)鋁脅迫產(chǎn)生抗性反應(yīng)的先端。同時(shí)，細(xì)胞壁組分變化可能是對(duì)鋁毒害的一種適應(yīng)機(jī)制，那么胡枝子在鋁脅迫下誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成和有機(jī)酸分泌之間是否存在對(duì)應(yīng)關(guān)系、胼胝質(zhì)形成是否可能具有一定的抗性作用、具體形成的受控因素，這些內(nèi)容的研究對(duì)于了解鋁脅迫下胡枝子響應(yīng)機(jī)制都是十分必要的。因此，本研究選取耐鋁性存在顯著差異的兩個(gè)胡枝子品種作為研究對(duì)象，探索鋁調(diào)控處理下，濃度、時(shí)間以及外加試劑(陰離子通道抑制劑、DDG、甘露醇等)對(duì)胼胝質(zhì)形成的作用機(jī)制，初步明確胼胝質(zhì)的形成變化規(guī)律，分析其在胡枝子耐鋁方面的生理作用以及與有機(jī)酸分泌之間的關(guān)系，為進(jìn)一步開(kāi)展鋁脅迫下，植物反應(yīng)和傷害機(jī)理提供一定理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料和生長(zhǎng)條件

二色胡枝子和截葉胡枝子的種子預(yù)處理和催芽方法參見(jiàn)［27］。當(dāng)幼芽長(zhǎng)至2—3 cm時(shí)，移至盛有0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液的盆子中培養(yǎng)5—7 d后，兩個(gè)胡枝子品種都分別選取較為一致的幼苗進(jìn)行鋁處理。所有試驗(yàn)在光照培養(yǎng)室中進(jìn)行，溫度為(25±2)℃，相對(duì)濕度為(65±5)%，光強(qiáng)為300 μmol光子m－2s－1，晝夜循環(huán)為光14 h/黑暗10 h。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1不同濃度鋁處理下對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)鋁處理濃度(pH 4.5)，分別為:含0、50、100和200 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液。幼苗經(jīng)不同濃度鋁處理24 h后，分別切取根尖(0—1.0 cm)10條待測(cè)。前期對(duì)鋁脅迫下兩個(gè)胡枝子品種相對(duì)根伸長(zhǎng)、根尖鋁含量進(jìn)行了測(cè)定并已發(fā)表［26，28］，此處僅測(cè)定根尖胼胝質(zhì)含量。

1.2.2鋁處理下不同根段胼胝質(zhì)的變化

幼苗用含50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h后，切取0—0.5，0.5—1.0，1.0—1.5，1.5—2.0 cm長(zhǎng)的根段各20條。分別測(cè)定根段內(nèi)鋁含量和胼胝質(zhì)含量。

1.2.3胼胝質(zhì)形成隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化

用0.5 mmol/L CaCl2溶液配制成50 μmol/L鋁處理溶液(pH 4.5)，分別處理幼苗1、2、3、6、9、12、18、24 h后，切取根尖(0—1.0 cm)各20條待測(cè)。鋁處理24 h后，改用不含鋁的0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液繼續(xù)處理，不同時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理共切取3次。測(cè)定項(xiàng)目包括胼胝質(zhì)含量和根尖鋁含量。

1.2.4不同陰離子通道抑制劑對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響

為了研究鋁脅迫下不同陰離子通道抑制劑對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響。幼苗用含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液處理，試驗(yàn)設(shè)加或不加10 μmol/L陰離子通道抑制劑［尼氟滅酸(niflumic acid，NIF)、苯甲酰甲醛(phenylglyoxal，PG)和蒽-9-羧酸(anthracene-9-carboxylic acid，A-9-C)］的不同處理。處理24 h后切取根尖(0—1.0 cm)10條，測(cè)定胼胝質(zhì)含量。

1.2.52-去氧-D-葡萄糖(DDG)和甘露醇(Mannitol，簡(jiǎn)寫(xiě)為Man.)對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響

幼苗先用100 μmol/L DDG處理1 h，沖洗干凈，再用含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h。50 mmol/L Man.則是直接和含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)混合后處理24 h。各處理結(jié)束后，切取根尖(0—1.0 cm)10條，測(cè)定胼胝質(zhì)含量。

1.2.6La對(duì)胼胝質(zhì)形成影響

為了驗(yàn)證胼胝質(zhì)形成是否為鋁脅迫下的專(zhuān)性反應(yīng)，幼苗分別用含0、50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L LaCl3和50 μmol/L AlCl3+LaCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h。然后切取根尖(0—1.0 cm)10條，測(cè)定胼胝質(zhì)含量。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1根尖Al含量測(cè)定

Al處理24 h后切取根尖(0—1.0 cm)，進(jìn)行根尖總Al含量測(cè)定，測(cè)定方法參見(jiàn)［28］。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2胼胝質(zhì)含量測(cè)定

胼胝質(zhì)含量測(cè)定方法參考Kohle等［29］，具體過(guò)程參見(jiàn)孫清斌等［27］。每個(gè)處理重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1兩個(gè)品種的相對(duì)根伸長(zhǎng)率、根尖鋁含量和胼胝質(zhì)的形成

前期實(shí)驗(yàn)表明，隨鋁處理濃度增加，兩個(gè)胡枝子品種的相對(duì)根伸長(zhǎng)率均呈下降趨勢(shì)，根尖鋁含量則呈上升趨勢(shì)［26，28］。與之相對(duì)應(yīng)，根尖胼胝質(zhì)形成的量也是表現(xiàn)出較為明顯的增加趨勢(shì)(圖1)。說(shuō)明植物吸收的鋁越多，根伸長(zhǎng)受到抑制程度越大，根尖所形成的胼胝質(zhì)也增多。另外，不同濃度鋁處理下相對(duì)根伸長(zhǎng)率都是二色胡枝子(耐性品種)高于截葉胡枝子(敏感品種)，根尖鋁含量則是耐性品種顯著小于敏感品種［26，28］，而胼胝質(zhì)形成量也有同樣的規(guī)律(圖1)，說(shuō)明胼胝質(zhì)形成量與根尖鋁含量相對(duì)應(yīng)。

圖1　鋁處理對(duì)胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響Fig.1Effect of Al on callose content in root apices of Lespedeza plants，L.bicolor and L.cuneataSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Data are means±SD

2.2不同根段胼胝質(zhì)形成和根尖鋁含量變化

圖2是鋁處理下兩個(gè)品種不同根段胼胝質(zhì)形成量和根尖鋁含量的結(jié)果。由圖可知，不同根段胼胝質(zhì)的形成量與根尖鋁含量是正相關(guān)的;敏感品種根尖鋁和胼胝質(zhì)的含量是0—0.5 cm段顯著高于其它根段，耐性品種也有較明顯的降低趨勢(shì)，說(shuō)明此段是鋁作用的主要部位;對(duì)比品種間差別，發(fā)現(xiàn)根段0.5—2.0 cm內(nèi)品種間無(wú)顯著差別，差別主要在于0—0.5 cm處，說(shuō)明品種間耐鋁的差別主?要體現(xiàn)在根尖0—0.5 cm處，其它部位差別不大。

圖2　不同根段下胼胝質(zhì)形成和根尖鋁分布規(guī)律Fig.2Callose content and Al content in apical root segments of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD(n=3)

2.3根尖鋁含量和胼胝質(zhì)形成動(dòng)態(tài)變化

為了探索胼胝質(zhì)形成隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，做了50 μmol/L鋁處理24 h內(nèi)和之后12 h不加鋁處理下，兩個(gè)品種根尖鋁含量和胼胝質(zhì)形成的變化規(guī)律(圖3)。結(jié)果表明，50 μmol/L鋁處理下，隨時(shí)間變化兩個(gè)品種根尖鋁含量都是逐漸增加的，但前12 h內(nèi)，品種間無(wú)統(tǒng)計(jì)上的差異，之后敏感品種顯著高于耐性品種(圖3)。說(shuō)明兩個(gè)品種對(duì)鋁的吸附或吸收能力存在一定的差異。鋁處理24 h后再用0.5 mmol/L CaCl2處理，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間推移，兩個(gè)品種根尖鋁含量都在逐漸降低，耐性品種緩慢下降，敏感品種則是迅速下降后保持不變(圖3)。說(shuō)明仍有相當(dāng)一部分鋁依然牢固的吸附于根部組織上。與之相對(duì)應(yīng)胼胝質(zhì)的形成變化規(guī)律是:鋁脅迫下，敏感品種胼胝質(zhì)形成同鋁吸收趨勢(shì)比較吻合，耐性品種則在鋁處理6 h時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值隨后下降。鑒于以往結(jié)果，鋁脅迫下敏感品種不分泌任何有機(jī)酸，耐性品種大量分泌檸檬酸和蘋(píng)果酸，鋁處理3 h后開(kāi)始分泌，9 h時(shí)達(dá)最大值［25］，說(shuō)明胼胝質(zhì)的形成可能與有機(jī)酸的分泌存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系。24 h后去除鋁脅迫耐性品種胼胝質(zhì)的形成量并不顯著減少(圖3)，則印證了仍有相當(dāng)一部分鋁存在于細(xì)胞壁上的結(jié)果，從而使得根尖繼續(xù)產(chǎn)生胼胝質(zhì)。

2.4陰離子通道抑制劑對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響

鋁脅迫下有機(jī)酸是通過(guò)陰離子通道分泌出來(lái)，因此我們也探索了鋁與陰離子通道抑制劑脅迫下胼胝質(zhì)的形成狀況。結(jié)果顯示，鋁與陰離子通道抑制劑同時(shí)作用下，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成的影響與僅用鋁脅迫相比存在差別(圖4)，說(shuō)明存在于原生質(zhì)膜上的陰離子通道可能參與了胼胝質(zhì)的形成。同單獨(dú)加鋁處理相比PG+Al處理對(duì)兩個(gè)品種胼胝質(zhì)形成的無(wú)影響;NIF+Al處理抑制敏感品種胼胝質(zhì)的形成，對(duì)耐性無(wú)影響;A-9-C+Al處理顯著抑制兩個(gè)品種胼胝質(zhì)的形成。說(shuō)明不同陰離子通道抑制劑對(duì)有機(jī)酸分泌的抑制機(jī)制存在差別，從而直接影響胼胝質(zhì)的形成。

圖4　不同陰離子通道抑制劑處理下胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量Fig.4Effects of anion-hannel inhibitors on callose content in the root apices of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD (n=3)

2.5DDG與甘露醇對(duì)兩個(gè)胡枝子品種胼胝質(zhì)形成的影響

DDG被認(rèn)為是胼胝質(zhì)合成酶的抑制劑，用DDG處理之后，胼胝質(zhì)的形成應(yīng)該減少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，DDG+Al處理與單獨(dú)鋁處理相比，敏感品種的胼胝質(zhì)形成量顯著降低，耐性品種盡管也有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)差別(圖5)。說(shuō)明在外加干擾劑(DDG)作用下，面對(duì)逆境耐性品種表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。另外，甘露醇是一種維持滲透壓平衡的化學(xué)試劑。有研究表明，鋁脅迫可改變細(xì)胞的滲透壓［4］。結(jié)果顯示，它對(duì)兩個(gè)品種胼胝質(zhì)形成的影響無(wú)顯著差別(圖5)。對(duì)比品種間差別發(fā)現(xiàn)，兩種試劑(DDG和甘露醇)加鋁對(duì)耐性品種胼胝質(zhì)形成的影響同單獨(dú)加鋁處理無(wú)差異，說(shuō)明面對(duì)鋁脅迫所造成的逆境，耐性品種表現(xiàn)出的穩(wěn)定性強(qiáng)于敏感品種。

圖3　不同鋁處理下胡枝子根尖鋁含量和胼胝質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化Fig.3Kinetic course of Al content and callose content in apical root segments of two Lespedeza species Error bars represent±SD(n=3)

圖5　DDG與甘露醇對(duì)胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響(DDG:2-去氧-D-葡萄糖;Man:甘露醇)Fig.5　Effects of Al(50 μmol/L)，DDG(100μmol/L)and mannitol(50 mmol/L)application on callose content in the root apice of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD(n =3)

2.6鑭對(duì)胼胝質(zhì)形成影響

鑭通常被用來(lái)鑒定某些生理反應(yīng)是否為鋁脅迫下的專(zhuān)性反應(yīng)，如鑭可阻塞Ca2+通道，抑制有機(jī)酸釋放，從而被認(rèn)為鋁脅迫下的專(zhuān)性反應(yīng)［25］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，鑭單獨(dú)處理也能大量誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成(圖6)，說(shuō)明植物合成胼胝質(zhì)并非鋁脅迫下的專(zhuān)性反應(yīng);誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成過(guò)程中除了Ca2+信號(hào)通道參與之外，還應(yīng)該可能有其他信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)參與其中。另外，單獨(dú)鑭處理下胼胝質(zhì)的形成是耐性品種顯著高于敏感品種，Al+La處理更是顯著高于其它處理，說(shuō)明在鋁毒害下鑭抑制有機(jī)酸釋放時(shí)，鑭、鋁同時(shí)處理，其毒害效應(yīng)有疊加趨勢(shì)。結(jié)合敏感品種各處理結(jié)果，除單獨(dú)加鋁處理之外，相比耐性品種+La處理(單獨(dú)或混合)胼胝質(zhì)形成均顯著降低，說(shuō)明胼胝質(zhì)的形成可能有一定的抗性意義。

圖6　鋁、鑭對(duì)胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響Fig.6Effects of Al and La treatments on callose content in the root apex of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD (n=3)

3　討論

3.1鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成和有機(jī)酸分泌的關(guān)系

鋁脅迫下不同植物都會(huì)有相應(yīng)的應(yīng)對(duì)機(jī)制。耐鋁機(jī)制以外排為主的植物中，分泌有機(jī)酸是其最主要的途徑之一。根據(jù)鋁脅迫與有機(jī)酸分泌的響應(yīng)時(shí)間差，有機(jī)酸分泌分兩種模式，Ⅰ類(lèi)模式:植物可迅速對(duì)鋁脅迫做出反應(yīng)，在數(shù)十分鐘內(nèi)即可大量釋放出有機(jī)酸;Ⅱ類(lèi)模式:植物存在明顯的滯后效應(yīng)，一般需數(shù)小時(shí)后才有明顯的有機(jī)酸分泌［30］。本課題組以往研究表明，耐性胡枝子品種鋁處理3 h后才開(kāi)始分泌有機(jī)酸，9 h達(dá)到最大值［25］，存在明顯的滯后效應(yīng)，其分泌模式應(yīng)屬于II類(lèi)模式。通常認(rèn)為，Ⅰ類(lèi)有機(jī)酸分泌模式可能與質(zhì)膜陰離子通道被激活有關(guān)，Ⅱ類(lèi)分泌模式則可能與耐性基因的誘導(dǎo)有關(guān)［31］。楊建立進(jìn)一步認(rèn)為，誘導(dǎo)的基因可能與有機(jī)酸的代謝，細(xì)胞膜或液泡膜上離子通道的開(kāi)閉，線粒體膜上的有機(jī)酸的運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程相關(guān)聯(lián)［32］。因此，鋁脅迫下胡枝子分泌有機(jī)酸過(guò)程應(yīng)該與基因誘導(dǎo)有關(guān)，其分泌過(guò)程也是較為復(fù)雜的。

通過(guò)分析兩個(gè)品種根尖胼胝質(zhì)形成的動(dòng)態(tài)結(jié)果發(fā)現(xiàn):耐性品種根尖鋁吸收同胼胝質(zhì)形成之間具有非同步性，鋁脅迫下6 h時(shí)胼胝質(zhì)形成出現(xiàn)一個(gè)峰值(圖3)，此時(shí)恰處于有機(jī)酸分泌量逐漸增加過(guò)程。二者結(jié)合起來(lái)分析，可推斷為由于有機(jī)酸的分泌，降低了鋁毒害效應(yīng)，從而可能減少了胼胝質(zhì)的形成。將鋁脅迫下陰離子通道抑制劑對(duì)胡枝子有機(jī)酸分泌［25］和胼胝質(zhì)形成(圖4)的結(jié)果結(jié)合起來(lái)分析發(fā)現(xiàn)，PG對(duì)有機(jī)酸分泌無(wú)影響，也不影響Al脅迫下胼胝質(zhì)的形成;NIF可以刺激檸檬酸分泌(達(dá)7倍之多)，對(duì)蘋(píng)果酸無(wú)影響(但有機(jī)酸分泌總量增加)，從而減少胼胝質(zhì)形成(敏感差異顯著，耐性差異有降低趨勢(shì));A-9-C在完全抑制有機(jī)酸分泌的同時(shí)也顯著抑制了胼胝質(zhì)形成。PG與NIF對(duì)兩者間的作用結(jié)果比較容易理解，A-9-C的結(jié)果可解釋為由于對(duì)植物傷害較大，直接破壞了細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)作用［25］。因此，鋁脅迫下誘導(dǎo)有機(jī)酸釋放和胼胝質(zhì)形成之間可能有著共同的調(diào)控因子。

另外，胼胝質(zhì)形成的專(zhuān)性鑒定結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了胼胝質(zhì)形成過(guò)程可能受到有機(jī)酸釋放的影響。鑭作為一種金屬陽(yáng)離子，通常被認(rèn)為是Ca通道抑制劑，在微摩爾濃度下也會(huì)限制植物根系生長(zhǎng)［33］。單獨(dú)La處理耐性胡枝子品種不分泌任何有機(jī)酸(檸檬酸和蘋(píng)果酸)［25］，但胼胝質(zhì)形成量高于敏感品種，這就說(shuō)明了無(wú)有機(jī)酸釋放，耐性品種受到傷害時(shí)，形成的胼胝質(zhì)更多。Al+La處理顯著降低了耐性品種有機(jī)酸(蘋(píng)果酸)釋放［25］，從而形成胼胝質(zhì)的量高于敏感品種。此結(jié)果從另一方面也說(shuō)明有機(jī)酸釋放與胼胝質(zhì)形成可能存在共同的調(diào)控機(jī)制。

因此，胼胝質(zhì)形成和有機(jī)酸分泌可能存在相互協(xié)調(diào)的關(guān)系。關(guān)于胼胝質(zhì)形成［34］和有機(jī)酸分泌［32］的生理調(diào)節(jié)過(guò)程都有相應(yīng)報(bào)道。Ma等認(rèn)為，鋁脅迫下有機(jī)酸分泌的滯后現(xiàn)象與誘導(dǎo)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成有關(guān)［35］。楊建立推測(cè):鋁首先激活某些基因，然后這些基因編碼有機(jī)酸載體和陰離子通道蛋白合成，由此開(kāi)始有機(jī)酸的分泌［32］。信號(hào)傳導(dǎo)是基因誘導(dǎo)的前提，Ca2+濃度的瞬間變化在植物信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中被認(rèn)為占主導(dǎo)因素［36］。因此，誘導(dǎo)有機(jī)酸的分泌過(guò)程也可能有Ca2+的參與調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在認(rèn)為胼胝質(zhì)合成可能是由于鋁毒害作用，引起膜內(nèi)外電壓發(fā)生變化，誘導(dǎo)膜的超極化，通過(guò)Ca通道形成一個(gè)瞬間Ca流［37］，誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度提高，使得蛋白酶激活胼胝質(zhì)合成酶，增加胼胝質(zhì)在細(xì)胞壁形成的量［38］。因而可以認(rèn)為，兩個(gè)生理反應(yīng)過(guò)程可能同時(shí)是因?yàn)殇X誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］變化，一方面蛋白激酶激活，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)迅速合成，同時(shí)激活調(diào)控有機(jī)酸分泌的基因，一旦此過(guò)程完成，即刻開(kāi)始大量分泌有機(jī)酸，相應(yīng)的蛋白激酶進(jìn)一步調(diào)控減少耐性品種胼胝質(zhì)的形成。當(dāng)然調(diào)控兩個(gè)過(guò)程中某些步驟的蛋白也可能是由細(xì)胞核內(nèi)又重新合成的。同時(shí)，鑭處理阻塞Ca通道，抑制耐性胡枝子有機(jī)酸分泌［25］，不影響其形成胼胝質(zhì)(圖6)，表明逆境條件下原生質(zhì)體內(nèi)［Ca2+］變化與調(diào)控有機(jī)酸分泌生理過(guò)程關(guān)系更加密切，原生質(zhì)體內(nèi)［Ca2+］降低(波動(dòng))也可能是誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成的另一信號(hào)因子。當(dāng)然，其信號(hào)傳導(dǎo)也可能不只是由于［Ca2+］簡(jiǎn)單變化引起的，還可能是由其它信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)參與其中的(如IP3等)。另外，質(zhì)膜上面也可能存在直接誘導(dǎo)蛋白激酶啟動(dòng)的膜受體［10］。此外，Bhuja等認(rèn)為，胼胝質(zhì)的形成并不是簡(jiǎn)單地由Ca2+的變化所引起的，應(yīng)該還包含其它調(diào)節(jié)因素［2］。由此可見(jiàn)，由蛋白激酶和Ca2+參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一個(gè)極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，鋁脅迫下細(xì)胞如何調(diào)控兩個(gè)生理過(guò)程尚有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支撐。

3.2胼胝質(zhì)的形成僅僅是鋁脅迫下的毒害指標(biāo)

細(xì)胞壁作為植物與外界環(huán)境的第一道屏障，參與體內(nèi)外一系列代謝活動(dòng)，在抵抗逆境方面有著獨(dú)特的作用。細(xì)胞壁是植物細(xì)胞區(qū)域劃分中質(zhì)外體的主要組成部分，鋁存在具有改變質(zhì)外體結(jié)構(gòu)和功能的潛力［34］。鋁脅迫下將會(huì)使得正常代謝的纖維素合成酶受阻，胼胝質(zhì)合成酶啟動(dòng)，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成［34］。胡枝子的耐鋁機(jī)制以外排為主［25］，根尖所積聚的鋁越少，則說(shuō)明該品種耐鋁性越強(qiáng)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文數(shù)據(jù)也印證了此觀點(diǎn)，即耐性品種根尖鋁含量［26］、胼胝質(zhì)形成量都較低，且隨鋁濃度的增加，胼胝質(zhì)形成量也隨之增加(圖1，圖2)。這些數(shù)據(jù)表明，將胼胝質(zhì)形成定義為鋁脅迫下的毒害指標(biāo)應(yīng)該是正確的。

根尖通常被認(rèn)為是鋁作用的主要部位，有機(jī)酸也主要在這一段分泌［39-40］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣支持該觀點(diǎn)，不同品種根段只有根尖0—0.5 cm處存在顯著差別(圖2)。Zheng和Yang認(rèn)為，根尖部細(xì)胞活性越強(qiáng)，鋁所產(chǎn)生的毒害越強(qiáng)［41］，那么毒害越強(qiáng)的部位是不是更加需要有相應(yīng)的抵抗機(jī)制?因此，鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成除了說(shuō)明其是毒害指標(biāo)之外，是否還具有抵抗鋁毒害的作用?這似乎也是一個(gè)很讓人產(chǎn)生興趣的課題，本試驗(yàn)鑭處理結(jié)果也直接支持這樣的觀點(diǎn)。鑭也是一種毒害元素，也能誘導(dǎo)大量胼胝質(zhì)形成。由于鑭抑制耐性品種有機(jī)酸的釋放，所形成胼胝質(zhì)的量顯著高于敏感品種相應(yīng)的處理(圖6)，表明胼胝質(zhì)形成可能也是面對(duì)脅迫環(huán)境的一種抗性反應(yīng)。另外，鋁處理下加入DDG，同敏感品種相比耐性品種依然表現(xiàn)出較強(qiáng)穩(wěn)定性(胼胝質(zhì)形成量不減)(圖5)。結(jié)合上面3.1討論內(nèi)容，鋁脅迫下有機(jī)酸分泌和胼胝質(zhì)形成可能存在共同調(diào)節(jié)機(jī)制，有機(jī)酸分泌前期有大量胼胝質(zhì)形成且耐性品種高于敏感品種的事實(shí)，也再次表明鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成可能并不僅僅是簡(jiǎn)單的毒害指標(biāo)。以往也有報(bào)道認(rèn)為，鋁脅迫下胼胝質(zhì)的聚集被認(rèn)為是對(duì)植物抵抗逆境脅迫有著積極的作用［21，23-24］。Hossain等指出，胼胝質(zhì)合成的增加，誘導(dǎo)半纖維素合成的增加，從而提高細(xì)胞壁的剛性，達(dá)到抵抗逆境的作用，從而認(rèn)為，合成半纖維素的前體物質(zhì)主要是胼胝質(zhì)［42］。同時(shí)，近年來(lái)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了胼胝質(zhì)在植物抵御病害方面有著重要意義［13-17］。盡管如此，對(duì)于胼胝質(zhì)在抵抗鋁脅迫作用方面的研究還是很欠缺的。Zheng和Yang認(rèn)為，鋁脅迫下胼胝質(zhì)的形成是一種保護(hù)反應(yīng)、還是一種簡(jiǎn)單的傷害作用、甚至是一種無(wú)害的反應(yīng)都是尚無(wú)定論的［41］。因此，進(jìn)一步深入研究以確定胼胝質(zhì)的真正生理作用是很有必要的。

3.3鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成的可能受控因素

由于鋁毒害的產(chǎn)生實(shí)際上是一系列的傷害，植物對(duì)其抗性反應(yīng)也是多重的。胼胝質(zhì)形成被認(rèn)為鋁脅迫下是一個(gè)快速而又敏感的生理反應(yīng)，數(shù)分鐘內(nèi)纖維素合成酶完全失活，胼胝質(zhì)大量形成［12］。由于該反應(yīng)經(jīng)歷時(shí)間極短，其形成應(yīng)該是鋁處理濃度的高低，持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短都會(huì)影響。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)印證了胼胝質(zhì)的形成受鋁毒害濃度高低(圖1)、時(shí)間長(zhǎng)短(圖3)的影響。另外，通過(guò)上面討論La對(duì)胼胝質(zhì)形成的影響發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)形成可能受控于信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)［Ca2+］參與。結(jié)合陰離子通道抑制劑結(jié)果分析證明，胼胝質(zhì)形成的調(diào)控過(guò)程可能也有陰離子通道的參與。以往對(duì)耐性品種分泌有機(jī)酸的研究表明，A-9-C抑制兩種有機(jī)酸分泌［25］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，A-9-C完全抑制有機(jī)酸分泌的同時(shí)也顯著降低了胼胝質(zhì)形成(圖4)，這A-9-C可能是對(duì)植物傷害較大，直接破壞了細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)作用［25］，從而說(shuō)明胼胝質(zhì)的形成可能受有機(jī)酸釋放的調(diào)控。

除此之外，胼胝質(zhì)形成也受到細(xì)胞膨壓所調(diào)控。甘露醇預(yù)處理可以降低鋁脅迫下的膨壓，增加細(xì)胞間空隙，從而便于可溶性物質(zhì)在質(zhì)外體的運(yùn)輸［4］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘露醇的加入有降低敏感品種胼胝質(zhì)形成的趨勢(shì)(圖5)。因此，盡管甘露醇的加入并不一定能夠緩解鋁對(duì)共質(zhì)體的毒害，但是由于其可以維持質(zhì)外體正?？臻g結(jié)構(gòu)，從而可以減少胼胝質(zhì)的形成。由于胼胝質(zhì)合成是由胼胝質(zhì)合成酶來(lái)完成的，那么底物多少將直接決定胼胝質(zhì)的合成量。DDG被認(rèn)為是參與UDPG和GDPG的代謝過(guò)程，可以限制寡糖脂鍵的生物合成，從而限制蛋白糖基化，最終限制胼胝質(zhì)的形成［43］。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，DDG處理顯著降低敏感品種胼胝質(zhì)的合成(圖6)。因此，DDG和甘露醇處理胼胝質(zhì)的合成表觀效果類(lèi)似，但實(shí)際上并不一定降低鋁產(chǎn)生的毒害，原因在于它們的作用機(jī)制確實(shí)有著本質(zhì)上的差異。當(dāng)然，除了上述幾種因素之外，胼胝質(zhì)的形成還可能受到其它多種因素的調(diào)節(jié)作用。

4　結(jié)論

耐性品種在鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成與有機(jī)酸分泌可能存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系;胼胝質(zhì)形成是植物鋁脅迫下敏感指標(biāo);在一定條件下，特別是有機(jī)酸分泌前可能會(huì)發(fā)揮一定的抗性作用;鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成受多種外界因素(濃度、時(shí)間、有機(jī)酸分泌，滲透壓平衡等)影響。

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Analysis of variations in and factors affecting callose formation in response to al stress in Lespedeza Root Tips

SUN Qingbin1，2，SHEN Renfang1，*，YIN Chunqin2，ZHAO Xueqiang1
1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China
2 College of Environmental Science and Engineering，Hubei Institute of Technology，Huangshi 435003，China

Abstract:Lespedeza speices can grow very well in infertile acidic soils as native pioneer plants.The reasons why such plants are well adapted to these soils might be due to a combination of mechanisms.Al toxicity is the primary factor limiting plant growth in acidic soils.Our previous results indicated that secretion of malate and citrate from roots was related to the high Al-resistance of Lespedeza.The objective of this study was to investigate the formation of callose under Al stress and its regulating factors in two Lespedeza species with different Al resistance，and attempted to explore the relative role of callose formation and organic acid exudation in Al toxicity or resistance of Lespedeza.The results showed that increased Al uptake was associated with increased callose formation in both Lespedeza species.The differences in Al tolerance between the two species were mainly expressed at the root apical 0—0.5 cm.Moreover，the callose formation was similar to root Al uptake for Al－sensitive species，but not for Al-tolerant species，of which callose formation peaked at 6 h of Al treatment and thenbook=1074,ebook=186decreased.Callose formation of the tolerant species was not obviously reduced following removal of Al from the culture.Furthermore，no obvious differences in callose formation were observed under treatment with PG(phenylglyoxal，anionchannel inhibitor)plus Al as compared to Al treatment alone in both species.NIF(niflumic acid，anion-channel inhibitor) plus Al treatment inhibited callose formation in the Al-sensitive species，but not in the Al-tolerant species.Callose formation was inhibited by A-9-C(9-anthracene carboxylic acid，anion-channel inhibitor)plus Al treatment in both species.Compared with Al treatment alone，DDG plus Al treatment caused a significant reduction in callose formation in the Alsensitive species but not in the Al-tolerant species.No differences in callose formation were observed for both species following mannitol treatment.Callose formation in response to La treatment was significantly higher in the Al-tolerant species than in the Al-sensitive species and was still higher following treatment with both Al and La.However，no differences in callose formation in Al-sensitive species were detected among treatments.In summary，callose synthesis may be regulated in conjunction with organic acid exudation.Callose formation may be a sensitive indicator of Al stress and may also function in Al tolerance before organic acids are secreted from roots.Finally，callose formation may be dependent on many factors，including Al concentration，treatment time，organic acid exudation，and osmotic pressure.Further studies are required to examine these additional factors to determine the complex mechanisms mediating callose formation.

Key Words:Lespedeza;Al stress;callose;organic acids

*通訊作者

Corresponding author.E-mail:rfshen@issas.ac.cn

收稿日期:2014-06-09;網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-07-09

基金項(xiàng)目:土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題(0812201225);湖北省自然基金面上項(xiàng)目(2014CFC1089);湖北省礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(2013104);湖北理工學(xué)院引進(jìn)人才項(xiàng)目(10yjz04R);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973項(xiàng)目) (2014CB441000)

DOI:10.5846/stxb201406091185