腺苷預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用及其機制

尉娜，李靜，李娟，譚軍

(新鄉醫學院第三附屬醫院，河南新鄉 453003)

腺苷預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用及其機制

尉娜，李靜，李娟，譚軍

(新鄉醫學院第三附屬醫院，河南新鄉 453003)

目的 探討腺苷預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用及其機制。方法 將健康雄性成年SD大鼠224只隨機分為假手術組、腺苷預處理后假手術組、缺血再灌注組和腺苷預處理組，每組56只。各組均采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型，假手術組及腺苷預處理后假手術組不插線栓；手術前3天，假手術組和缺血再灌注組腹腔注射生理鹽水，腺苷預處理后假手術組和腺苷預處理組腹腔注射腺苷注射液。各組于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠16只，并制備大腦組織切片。應用HE染色觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質及海馬神經元的形態學改變，采用免疫組化法觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質及海馬區Nestin陽性細胞數。結果 HE染色：假手術組、腺苷預處理后假手術組腦組織各層神經元排列整齊、規則，無壞死細胞。缺血再灌注組缺血再灌注3天，大鼠腦皮質及海馬神經元排列稀疏，有崩解、丟失現象；缺血再灌注7、14、21天，上述病理變化減緩。腺苷預處理組在相應時間點較缺血再灌注組腦組織病理改變有明顯改善，尤以7天后改善更明顯。免疫組織化學染色：假手術組、腺苷預處理后假手術組皮質少見Nestin陽性細胞表達，海馬區有少量Nestin陽性細胞表達；缺血再灌注組、腺苷預處理組Nestin陽性細胞數量于再灌注3天開始增加，缺血再灌注組于7天達高峰，腺苷預處理組于14天達高峰，隨后開始逐漸下降；腺苷預處理組各時間點皮質、海馬區Nestin陽性細胞數量均明顯高于缺血再灌注組(P均<0.05)。結論 腺苷預處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經元的損傷程度，可能與其促進內源性神經干細胞的增殖有關。

腦缺血再灌注；腺苷；內源性神經干細胞；大鼠

缺血性腦血管病是一類常見病、多發病，腦缺血后神經細胞損傷的不可再生性導致其極高的致殘率與病死率。減輕腦缺血后的神經損傷、提高腦組織對缺血的耐受一直是臨床預防和治療缺血性腦血管病的重點和難點。本研究即探討腺苷預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠內源性神經干細胞(NSCs)增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠224只，體質量250～300 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20030320、規格：6 mg/2 mL)，Nestin多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Nikon MODEL YS100顯微鏡(Nikon)，照相顯微鏡HPIAS-2000顯微圖象定量分析系統(鄭州太陽電子科技有限公司)。

1.2 造模與分組處理 將224只大鼠隨機分為假手術組、腺苷預處理后假手術組、缺血再灌注組和腺苷預處理組，各56只。各組均采用改良尼龍線栓塞法制備大腦中動脈阻塞模型[1,2]；阻斷大腦中動脈2 h后，輕輕向外抽拉尼龍線至頸外動脈主干，大腦動脈Willis環和大腦中動脈已恢復血供，保持體溫至清醒。假手術組及腺苷預處理后假手術組不插線栓，其余處理同缺血再灌注組和腺苷預處理組。假手術組和缺血再灌注組于手術前3天開始腹腔注射生理鹽水，2 mL/次、1次/d；腺苷預處理后假手術組和腺苷預處理組于手術前3天開始腹腔注射腺苷注射液，劑量為1.5 mg/kg，生理鹽水稀釋到2 mL，1次/d。大鼠術后單籠飼養，自由飲水和進食。

1.3 相關指標觀察 各組根據再灌注時間于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠14只，取出大腦至培養皿中，切取視交叉前后各2 mm厚的腦組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中固定24 h，脫水透明，石蠟包埋，20 μm切片，用于HE染色及免疫組化染色。

1.3.1 皮質及海馬區神經元形態改變 采用HE染色法。將制備好的切片脫蠟、水化，浸入蘇木素染液，淡氨水中返藍，伊紅染液染色3～4 min，脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.2 皮質及海馬區NSCs增殖情況 采用免疫組化染色法。按照Nestin免疫組化染色試劑盒說明書進行，光鏡觀察并應用HPIAS-2000顯微圖像處理系統采集圖片，每張切片隨機取8～10個視野，計數Nestin陽性細胞數，求其平均值為該張切片Nestin陽性細胞數。Nestin陽性判斷標準：胞質呈棕褐色，胞體呈圓形、橢圓形、椎體形和三角形等，排列不規則，有聚集現象，并可見有深染的1個或多個突起，胞核淡染。

2 結果

2.1 各組皮質及海馬區神經元形態學變化 假手術組、腺苷預處理后假手術組皮質各層神經元排列緊密而整齊，結構清晰，胞體飽滿，分布均勻，無數量減少及異常形態學改變，未見到死亡神經元；海馬CAI區錐體細胞層排列規則、緊致，細胞輪廓清楚。缺血再灌注3天，大腦皮質、海馬區神經元排列稀松，神經組織失去完整結構，有細胞破裂、胞核溶解現象，細胞周圍高度水腫，梗死周圍有膠質細胞增殖。再灌注7、14、21天上述病理改變趨勢減緩。腺苷預處理組在相應再灌時間點較缺血再灌注組腦組織病理改變明顯改善，缺血再灌注7天改善尤為明顯。見插頁Ⅲ圖4。

2.2 各組皮質及海馬區NSCs增殖情況比較 見表1、2。

表1 各組不同時間點皮質Nestin陽性細胞數量比較±s)

注：與缺血再灌注組比較，▲P<0.05。

表2 各組不同時間點海馬區Nestin陽性細胞數量比較±s)

注：與假手術組、腺苷預處理后假手術組比較，▲P<0.01；與缺血再灌注組比較，★P<0.05。

3 討論

腦缺血預處理(CIP)是指對腦進行二次或多次短暫的亞致死性缺血、缺氧或藥物預處理，調動機體組織的自身保護機制，達到減輕腦缺血再灌注損傷的目的，CIP是目前認為較為有效地避免腦缺血再灌注損傷的治療方法，在實際臨床工作中多采用藥物預處理，目前常用藥物主要有中藥、麻醉藥、鈣離子通道拮抗劑等。研究發現，許多外源性藥物應用于腦缺血再灌注時，通過不同途徑刺激內源性腺苷的分泌來達到保護腦組織的目的[3]，因此我們考慮外源性腺苷也可以治療腦缺血再灌注損傷[4～6]。本研究腺苷預處理組在相應再灌時間點較缺血再灌注組腦組織缺血有明顯改善，缺血再灌注7天改善更明顯，證實腺苷預處理可改善大鼠腦缺血再灌注損傷。

近年研究發現，腦組織受到缺血性損傷時可以刺激內源性NSCs的增殖、分化，從而促進神經再生和功能的重建[7～9]。然而在這種狀態下的NSCs增殖能力十分有限，對受損腦組織的功能修復作用甚微。因此，深入研究腦缺血后NSCs增殖的發生機制及影響因素，通過不同途徑和方法促進內源性NSCs適時增殖和分化是治療缺血性腦血管病的關鍵。Nestin是能夠特異性表達在早期原始神經細胞上的分子標記物，在出生后表達停止，隨著干細胞分化、成熟，逐漸可以被膠質纖維酸性蛋白、神經絲蛋白等中間絲蛋白替代[10]。Nestin作為目前識別NSCs的重要標志蛋白之一，已被廣泛用于標記NSCs。Nestin陽性表達的細胞，可看作是NSCs[11～13]。本研究結果顯示，假手術組與腺苷預處理后假手術組皮質未見到Nestin陽性細胞，海馬區有少量Nestin陽性細胞，提示內源性NSCs在成年大鼠腦內基本處于靜息狀態。缺血再灌注組腦缺血再灌注后Nestin陽性細胞表達有所增加，說明腦損傷后存在內源性NSCs增殖。腺苷預處理組Nestin陽性細胞明顯多于缺血再灌注組，且隨處理時間延長表達增加，峰值出現在缺血再灌注后第14天；第21天Nestin陽性表達仍高于缺血再灌注組，說明腺苷可促進在體NSCs的增殖，并能增強NSCs的增殖能力。其可能的作用機制：腺苷主要通過4種膜受體發揮生物學效應，分別為A1、A2a、A2b和A3，A1腺苷受體可在NSCs上表達，其活化也能促進NSCs的增殖，活化的A1腺苷受體可能通過激活MEK/ERK和AKt信號通路，促進NSCs的增殖[14,15]。

綜上所述，腺苷預處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經元的損傷程度，其機制可能為促進局灶性腦缺血損傷后內源性NSCs增殖。

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新鄉市重點科技攻關項目(ZD2011-27)。

譚軍(E-mail: tanjun1997@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.011

R734.3

A

1002-266X(2016)20-0033-03

2015-10-13)