純化功能性大豆低聚糖酵母菌的篩選及發酵特性初步應用

陸薇幃，汪立平

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

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純化功能性大豆低聚糖酵母菌的篩選及發酵特性初步應用

陸薇幃，汪立平*

(上海海洋大學 食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)

摘要采用改良的WL培養基，運用DNS和HPLC相結合的方法檢測酵母菌對大豆乳清低聚糖的利用情況，從自然界中篩選和分離出能夠選擇性降解大豆乳清中蔗糖的酵母菌。試驗結果表明，酵母菌PL08對蔗糖具有極強的降解作用，發酵后所得功能性低聚糖的純度達到96.70%，是理想的目的菌種。通過18S rDNA序列對比對微生物種屬進行鑒定酵母菌PL08為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。同時研究了酵母菌PL08發酵大豆乳清廢水的動態過程表明，發酵30 h時，棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，蔗糖的降解率為93.46%，功能性低聚糖的純度達到94.12%，確定為最適發酵周期。

關鍵詞大豆低聚糖；序列分析；酵母菌發酵

大豆乳清是工業上生產大豆分離蛋白(SPL)和大豆濃縮蛋白(SPC)的副產物，含有相當豐富的大豆低聚糖，但由于處理費用高昂等原因多直接排放到外界，對環境造成嚴重的污染[1]，如果能夠采取低成本處理再利用方法，將是一個變廢為寶的過程。大豆低聚糖主要由棉籽糖、水蘇糖和蔗糖組成，其中棉籽糖和水蘇糖是具有功能性的糖類，屬于功能性低聚糖，其功能特性主要表現在：促進雙歧桿菌的增殖，防止腹瀉和便秘，改善血清脂質的作用，抗腫瘤等[2]。蔗糖為非功能性低聚糖。為了除去蔗糖，提高功能性低聚糖的純度，目前常規的分離方法[3]有：色譜柱分離法、膜分離法、酶法、微波提取法和酵母發酵法。

酵母發酵法即考慮微生物對底物利用的選擇性，篩選出優先利用蔗糖、最大限度保留功能性低聚糖的菌種[3]。酵母發酵法是一種綠色環保的制備方法，具有方便，周期短，成本低等優點，有望投放于工業化大生產，為實現生產方法的簡捷化提供基礎。EGOUNLETY和AWORH[4]通過實驗發現，經過發酵處理的大豆低聚糖，其蔗糖含量降低，棉籽糖的含量則基本穩定無變化，但水蘇糖在48 h完全降解。本文主要通過把WL培養基的碳源替換為蔗糖，從自然界分離出可利用蔗糖的酵母菌，進一步采用DNS、HPLC相結合的方法篩選出能夠高強度降解蔗糖而基本不利用功能性低聚糖的酵母菌，并對其鑒定，確定種屬。同時采用HPLC跟蹤測糖法對不同發酵時間各組分糖濃度進行分析，根據非功能性低聚糖最高降解率和功能性低聚糖最高保留率的原則確定最適發酵周期。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1酵母來源

土壤(葡萄根系周圍)；水果(市售蘋果、生梨、葡萄、桂圓等)。

1.1.2培養基

篩選培養基：改良的WL分離培養基[5]：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖50 g，瓊脂20 g，KH2PO40.55 g，KCl 0.425 g，CaCl20.125 g，MgSO40.125 g，FeCl30.002 5 g，MnSO40.002 5 g，蒸餾水1 000 mL。調pH值至6.5，121 ℃高壓滅菌20 min后每1 L培養基分別加1 mL儲液A和儲液B。儲液A：0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL水和10 mL酒精中；儲液B：250 mg氯霉素溶于10 mL酒精中。

種子培養基：酵母膏3 g，胰蛋白胨10 g，蔗糖20 g，麥芽浸膏3 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

發酵培養基：實驗室收集大豆濃縮蛋白乳清，外觀糖濃度8 °Brix，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3主要設備及試劑

3.加快有關權證審批，縮短申貸時限。針對土地、規劃、環評等證照審批慢的問題，建議政府有關部門加快建設用地、項目規劃、環評批復等審批效率，并加強各環節相互銜接，幫助企業早日達到融資條件，獲得信貸支持。

DKY控溫調速搖床，上海杜科設備公司；Epichemi 3 凝膠成像儀，美國 UVP 公司；Waters 2695-2489 HPLC (示差折光檢測器)，日本waters公司；氨基柱(Hanbon，型號：5 μm，250×4.6 mm)。DP307酵母菌DNA提取試劑盒，天根生物技術公司；實驗用引物，上海生工生物技術公司合成。液相用標準品：蔗糖(分析純)，棉子糖(α-A18313)，國藥集團化學試劑有限公司；水蘇糖(S120981)，上海晶純生化科技股份有限公司，純度均大于98%。

1.2方法

1.2.1酵母菌篩選方法

將預處理的樣品稀釋涂布于改良的WL培養基上，25 ℃培養箱中培養2～3 d，觀察菌落顏色及形態并進行革蘭氏染色用于鏡檢，按照顏色及形態的不同分離酵母菌，記錄并標號。將挑選所得的酵母菌于種子培養基中純化，以8%的接種量接種于發酵培養基，每8 h DNS跟蹤測糖，保留樣品進行HPLC檢測各組分糖含量。

1.2.2酵母菌的鑒定

DP307試劑盒提取 DNA，采用酵母菌18S rRNA基因引物OY1 (5’-AATAACTTTTCGAATCGCAT-3’)和OY2 (5’-AAGACTTTGATTTCTCGTA-3’)進行PCR擴增，PCR體系為30 μL：上下引物各1 μL(50 pmol/μL)，模板DNA 3 μL，Taq mix 15 μL，無菌雙蒸水補齊至30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min。

取3 μL的PCR產物于0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。將PCR產物純化后送至上海生工生物技術有限公司測序，將測序結果在NCBI數據庫進行Blast檢索在線比對分析，并通過 MEGA5 軟件構建系統發育樹。

1.2.3目的酵母菌的發酵方法

種子培養：將目的菌種活化后，轉接入種子培養基中，25 ℃、150 r/min培養24 h。

1.2.4分析檢測方法

發酵液總糖的測定：初篩按照DNS法測定總糖含量[6]。

發酵液各組分糖的定量測定：高效液相色譜分析法[7]。V(乙腈)∶V(超純水)=70∶30；流動相流速：1.00 mL/min；樣品進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測器溫度：40 ℃；檢測時間20 min。按照外標法計算發酵液中大豆低聚糖的含量。

酒精含量的測定：采用比重密度法測定。

菌體干重檢測：將發酵液離心,沉淀用蒸餾水洗滌兩次，所得菌體用2 mL蒸餾水懸浮后移至干燥皿，65 ℃下烘干至恒重，所得凈重即為細胞干重(g/L)。

2結果與分析

2.1分離的酵母菌表型特征

WL培養基廣泛用于酵母菌的快速鑒別中[5]。根據改良WL培養基菌落顏色和菌落形態，從自然界分離純化出能夠利用蔗糖的19株天然酵母。結果如表1。革蘭氏染色觀察19株菌落形態分為紡錘形和橢圓形。

表1　不同酵母菌株的菌落顏色與菌落形態

2.2DNS法測不同酵母發酵過程中總糖的變化

將大豆乳清發酵液水解后，根據葡萄糖標準曲線計算總糖含量并繪制菌體降糖曲線，見圖1，結果表明，自然界篩選的菌種對大豆乳清低聚糖的利用程度有明顯區別，有一部分能夠很好的利用大豆乳清廢水中的碳源，其中1號、8號、9號、14號4株菌種隨著發酵時間的延長，總糖濃度明顯降低，具有較強的降糖能力，保留樣液進行HPLC色譜分析。

圖1　菌體降糖曲線Fig.1　The curve of saccharide reducing for the yeasts

2.3HPLC法測酵母發酵過程中各組分糖的變化

根據圖1 DNS的測定結果，32 h總糖含量下降穩定，采用HPLC外標法測定出該時段4株酵母發酵液所含蔗糖、棉籽糖、水蘇糖的濃度，如表2。試驗結果表明，1號、14號、9號雖然有明顯的耗糖能力，但對于功能性低聚糖的消耗能力也很強，不符合目的菌種的特性；而8號既可以極大程度的利用大豆乳清廢水中的非功能性成分，利用率達到96.4%，而對于功能性成分沒有明顯的消耗作用，對棉籽糖和水蘇糖的降解率分別為12%和9.7%，功能性糖的純度高達96.7%，符合目的菌種的特性，標記為PL08。

表2　發酵32 h各組分糖的含量

2.4真菌 18S rDNA 的PCR擴增及測序結果分析

PCR擴增獲得約900 bp的特異性條帶，見圖2。將PCR擴增后的產物純化后送上海生工生物技術公司測序，得到的基因片段序列在NCBI數據庫中進行Blast檢索，最終結果為：PL08酵母與異常威克漢姆酵母(W. anomalus)序列相似，同源性為99%。將各序列與其相似度較大的基因序列載入MEGA5中，進行多重序列比較分析，構建系統發育樹的結果如圖3所示，PL08酵母與異常威克漢姆酵母(KP027011.1)基因相似度為100%。根據形態學及18S rDNA序列比對綜合分析，鑒定PL08為酵母與異常威克漢姆酵母，將該菌株18S rDNA序列上傳到Genbank，得到登陸號KT003715。相關文獻記載，該菌株是一種兼具了釀酒酵母和產酯酵母雙重特性的功能菌，常用于釀酒工業，安全無毒，對于以后應用到大豆乳清制備功能性低聚糖的安全性提供了保障。

1～5-PL08的PCR產物；6-Marker圖2　目標酵母菌PL08提取的18S rDNA的PCR電泳圖Fig.2　Gel electrophoresis analysis of 18S rDNA amplification

圖3　菌株PL08的 18S rDNA 系統發育進化樹Fig.3　Phylogenetic trees for 18S rDNA sequence of the strain PL08

2.5大豆乳清發酵過程分析

進行3次平行發酵實驗，根據酵母菌PL08純化功能性大豆低聚糖的發酵實驗數據，繪制細胞干重、蔗糖含量、酒精產量隨時間的變化曲線，如圖4所示。

圖4　酵母菌PL08發酵大豆乳清主要指標變化趨勢Fig.4　The metabolic curves of fermentation process

由圖4可知，6～21 h為對數生長期，隨著酵母菌PL08的生長，酒精產量逐漸升高，蔗糖大幅度消耗，是純化功能性大豆低聚糖的關鍵時期。21 h之后進入穩定期，細胞干重基本恒定，酒精產量快速積累，蔗糖含量消耗速率減緩，達到24 h時蔗糖含量基本保持穩定。

2.6最適發酵周期的確定

根據HPLC測得的酵母菌PL08在發酵過程中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖3種主要糖濃度的變化，所繪曲線如圖5所示。由圖5可知，發酵初始，6 h蔗糖的降解率僅為3.52%，隨著發酵時間延長蔗糖含量降低，30 h時蔗糖濃度低至0.93 mg/mL，降解速率逐步減緩，此時棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，功能性低聚糖的純度達到94.12%，蔗糖的降解率為93.46%。 30 h之后，由于糖供應量的不足，酵母PL08逐步開始利用功能性低聚糖，直至50 h，蔗糖被完全消耗，降解率達到100%，但棉籽糖和水蘇糖的保留率僅有9.88%和33.83%，不符合最大程度純化功能性低聚糖的目的，故確定30 h為最佳發酵周期。

圖5　發酵過程中各組分糖的變化Fig.5　The curves of the concentration of sugars in fermentation process

3結論

本研究通過采用改良WL培養基的方法，從自然界篩選出可純化功能性大豆低聚糖的優良酵母菌種PL08，所得功能性低聚糖純度達到96.7%，并通過18S rDNA 序列比對綜合分析鑒定該酵母菌PL08為異常威克漢姆酵母(W.anomalus)。根據實驗結果得，異常威克漢姆酵母菌PL08發酵大豆乳清30 h就可達到最佳的純化目的，此時棉籽糖和水蘇糖的保留率分別為87.90%和82.16%，功能性低聚糖的純度

達到94.12%，蔗糖的降解率為93.46%。繼續發酵跟蹤測糖發現，酵母菌PL08開始利用功能性低聚糖，其功能性低聚糖的保留率逐漸降低，故為符合高效率純化大豆低聚糖的目的，確定30 h為最佳發酵周期。綜上，所篩酵母菌PL08異常威克漢姆酵母較目前相關報道的文獻，具有純化力強，周期短的特點，此外該酵母菌兼具了釀酒酵母和產酯酵母雙重特性，對于以后應用到大豆乳清制備功能性低聚糖的安全性提供了保障。

參考文獻

[1]張閃閃,汪立平,王錫昌.利用大豆濃縮蛋白乳清制備水蘇糖的發酵條件[J].大豆科學,2008,27(1):137-140.

[2]盧義伯,潘超.大豆功能因子的研究進展[J].現代食品科技,2006,22(2):105-108.

[3]武嘉文,孔凡賓.從大豆乳清水中提取大豆低聚糖的方法[P].中國專利:CN1364763.2002.08.21.

[4]EGOUNLETY M,AWORH O C.Effect of soaking,dehulling,cooking and fermentation with Rhizopus oligosporus on the oligosaccharides,trypsin inhibitor,phytic acid and tannins of soybean (Glycine max Merr.),cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) and groundbean (Macrotyloma geocarpa Harms)[J].Journal of Food Engineering,2003,56(2):249-254.

[5]PALLMANN C L,BROWN J A,OLINEKA T L,et al. Use of WL medium to profile native flora fermentations[J].American Journal of Enology and Viticulture,2001,52(3):198-203.

[6]韓德權,章佳佳.DNS法在普魯蘭多糖發酵液中糖測定的研究[J].食品工業科技,2008,29 (2):285-286.

[7]王玉軍,紀偉東,李永平,等.高效液相色譜法測定大豆低聚糖中的棉籽糖和水蘇糖[J].現代食品科技,2010,26(7):750-752.

Isolation and identification of yeasts for purification of soy oligosaccharides and preliminary application of its fermentation characteristics

LU Wei-wei, WANG Li-ping*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTOne strain of yeast with high consumption ability to sucrose and high retention rate to stachyose and raffinose was isolated from nature through WL medium using DNS combined with HPLC. Rresults showed that strain PL08 had higher utilization ability for sucrose. The consumption rate for sucrose after fermentation reached 96.7%, while it almost could not utilize the raffinose and stachyose, which meet the requirements for the ideal strains. Through 18S rDNA partial gene sequence analysis, the strain PL08 was identified as Wickerhamomycesanomalus. The analysis on dynamic process of soybean whey fermented with yeast PL08 showed that fermentation time of 30h was determined as the optimum fermentation period. At this time point, the retention rate of raffinose and stachyose was 87.76% and 82.07% respectively, and that the degradation rate of sucrose was 93.46%.

Key wordssoybean oligosaccharides; 18S rRNA; yeast fermentation

收稿日期：2015-10-13，改回日期：2015-12-04

基金項目：上海市科委工程中心建設(11DZ2280300)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603029

第一作者：碩士研究生(汪立平教授為通訊作者，E-mail：lpwang@shou.edu.cn)。