基因工程大腸桿菌生產重組別藻藍蛋白(holo-SA-apcA)發酵條件優化

楊玉瑩，陳華新，徐云峰，姜鵬，趙瑾，陳亮*

1(廈門大學 生命科學學院，福建 廈門，361102)　2(中國科學院海洋研究所，實驗海洋生物學重點實驗室，山東 青島，266071)　3(青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室，山東 青島，266071)　4(黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島，266555)

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基因工程大腸桿菌生產重組別藻藍蛋白(holo-SA-apcA)發酵條件優化

楊玉瑩1，陳華新2,3*，徐云峰4，姜鵬2,3，趙瑾2,3，陳亮1*

1(廈門大學 生命科學學院，福建 廈門，361102)2(中國科學院海洋研究所，實驗海洋生物學重點實驗室，山東 青島，266071)3(青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室，山東 青島，266071)4(黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島，266555)

摘要利用Design-Expert 8.0軟件，對大腸桿菌產重組別藻藍蛋白(holo-SA-apcA)的發酵條件進行優化。首先運用Plackett-Burman兩水平設計，對影響重組蛋白表達量的8個因素進行評價，選擇有顯著影響的3個因素，即pH值、誘導溫度、接種量。在此基礎上，再用最陡爬坡實驗快速逼近以上3個因素的最大響應區域，最后經過Box-Behnken設計和響應面分析，通過求解回歸方程得到最優條件為：pH 8.0、誘導溫度18 ℃、接種量4%。在此條件下重復發酵實驗3次，重組蛋白表達量達52.3 mg/L，與預測值基本一致。

關鍵詞別藻藍蛋白；大腸桿菌；Plackett-Burman設計；優化

別藻藍蛋白(allophycocyanin)是藻類中一類重要藻膽蛋白，它與藻紅蛋白、藻藍蛋白和連接蛋白等一起構成藻膽體，吸收太陽光能用于光合作用。每分子的別藻藍蛋白含有2條結構相似的多肽鏈α和β，α亞基和β亞基分別含有約160～180個氨基酸殘基，二者的比例通常為1∶1，每個亞基上分別共價連接有1個藻膽色素分子。在離體狀態下，藻膽蛋白在適當波長光的激發后，會發射出強烈的熒光，可將其與各種抗體結合制成熒光探針，用于癌細胞及病毒表面抗原等生物大分子的檢測等工作中[1-2]。

藻膽蛋白作為熒光探針使用時，需要將其與抗體偶聯。目前最為普遍使用是生物素-親和素系統(biotin-avidin system，BAS)[3-5]，藻膽蛋白與鏈霉親和素通過化學交聯劑共價交聯，而抗體則是經過生物素標記，利用鏈霉親和素和生物素之間的結合，實現藻膽蛋白分子和抗體的間接偶聯。鏈霉親和素分子的4個亞基均可以結合1個生物素分子，具有非常高的Ka值。BAS系統具有高親和力、高特異性、高穩定性等特點，具有信號放大作用。

利用BAS系統需要分別制備藻膽蛋白和鏈霉親和素，成本較高，在交聯的過程中還可能會損失抗體活性和藻膽蛋白的熒光特性。本實驗室利用基因工程方法，將別藻藍蛋白α亞基基因與鏈霉親和素基因連接，形成融合基因，利用大腸桿菌表達系統，將該融合基因與藻膽蛋白裂合酶基因cpcS、藻紅膽素(PEB)生物合成關鍵基因Ho1，pebS在大腸桿菌中共表達[6-7]。通過發酵和蛋白分離純化，獲得了共價結合藻紅膽素的鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白(holo-SA-apcA)。Holo-SA-apcA不僅具有生物素結合能力，而且具有比天然的別藻藍蛋白更高的熒光量子效率，有望替代天然藻膽蛋白應用于免疫熒光分析和檢測中。

本研究采用Plackett-Burman設計，最陡爬坡實驗和響應面實驗相結合[8-9]，對重組大腸桿菌的條件進行優化。旨在快速高效優化重組大腸桿菌的發酵條件，提高holo-SA-apcA的表達量，為重組藻膽蛋白的應用奠定基礎。

1材料和方法

1.1菌株

基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/pCDF-SLA-cpcS/pRSF-Ho1-pebS，由本實驗室構建保存，含有兩種表達質粒。其中，表達質粒pCDF-SLA-cpcS攜帶鏈霉親和素基因和別藻藍蛋白α亞基基因組成的融合基因SLA，以及裂合酶基因cpcS。而pRSF-Ho1-pebS攜帶藻紅膽素生物合成酶基因Ho1和pebS。

1.2培養基和試劑

種子培養基：LB培養基(5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，pH 7.0)。

發酵培養基：TB培養基(12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母提取物，0.4 %甘油，10%磷酸緩沖液)，磷酸緩沖液：23.1 g/L KH2PO4，125.4 g/L K2HPO4，pH 7.4。

上述培養基中加入終質量濃度為100 μg/mL的卡那霉素和100 μg/mL壯觀霉素。

1.3培養方法

將活化好的重組大腸桿菌接種于含LB培養基中，振蕩培養過夜。將過夜培養物接種到裝50 mL或100 mL TB培養基的250 mL三角瓶中，并放于控溫搖床中培養(200 r/min)。接種量、培養溫度、誘導時機、IPTG濃度等因素依照“1.5 Plackett-Burman設計”。發酵結束后，離心收集菌體并放置于-20 ℃保存。

1.4重組蛋白的定量

結合色基的蛋白(holo-SA-apcA-PEB)表達量分析：菌體懸浮于磷酸緩沖液中，超聲波破碎菌體，離心后取上清液，用熒光分光光度計測520nm激發光下上清液在563nm處的熒光發射峰值。熒光值0～1000 a.u.范圍內, 重組蛋白熒光值與蛋白表達量呈線性關系, 即重組熒光蛋白的表達量(mg/L)。

(1)

1.5Plackett-Burman設計

試驗以重組大腸桿菌的培養溫度、誘導時機、接種量、裝液量、發酵培養基pH、誘導劑IPTG量、誘導溫度和誘導時長共8個因素進行兩水平設計，低水平為-1 ，高水平為 1 ，設計 3個虛擬變量來估計誤差，共N= 12 次試驗，以蛋白的表達量為響應值Y。表1為Plackett- Burman試驗設計。

表1　Plackett- Burman設計試驗參數和水平

1.6最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman實驗結果，選取pH、誘導溫度、接種量3個重要影響因素。根據PB試驗得到多元一次方程的系數大小和正負，確定最陡爬坡試驗各重要因素的步長和方向設計4組試驗，重要因素為正效應則提高因素水平，反之則降低因素水平。培養溫度、誘導時機、誘導時長和IPTG濃度都是正效應，后續實驗中取高水平值，裝液量是負效應，后續實驗中取相對低水平值。

表2　最陡爬坡試驗設計

1.7響應面分析優化設計

最陡爬坡試驗確定中心點后，通過Box-Behnken Design中心組合實驗對影響別藻藍蛋白亞基蛋白產量的因素進行分析，以接種量、發酵培養基pH、誘導溫度作為自變量，重組蛋白的表達量為響應值，建立3因素3水平響應面試驗模型，見表3。試驗點17個，析因點12個，用于估計誤差的零點5個。用Design-Expert 8.0軟件對實驗數據進行多元回歸分析。

表3　Box-Benhnken Design實驗的因素與水平

1.8驗證實驗

由BBD分析結果可知，當pH為8.0，誘導溫度為18.1 ℃，接種量為4%時，響應面達到最優值，且最優值為49.5 mg/L。故取pH為8.0，誘導溫度為18 ℃，接種量為4%，設3組重復，做驗證實驗。

2結果

2.1Plackett-Burman設計

Plackett-Burman試驗設計及結果見表4，方差分析顯示，8個因素中，誘導溫度、接種量、裝液量、pH、培養溫度的P值均小于0.05(表5)，表明這些因素是影響重組大腸桿菌發酵生產holo-SA-apcA的主要因素。裝液量實際是通過溶氧供氧水平從而影響重組蛋白表達的，但由于發酵工業上使用的發酵罐與本研究的搖瓶差別較大，裝液量優化研究意義不大。本研究取誘導溫度、接種量、pH 3個最顯著因素繼續進行發酵條件優化。

表4　Plackett-Bumran試驗設計及結果

表5　Plackett-Burman試驗方差分析

2.2最陡爬坡實驗設計

最陡爬坡實驗結果見表6，可以看出第2組實驗中，當pH為7.5，誘導溫度為19 ℃，接種量為6%時，重組蛋白的表達量最高。因此，將第2組水平作為中心復合設計的中心點進行進一步優化。

表6　最陡爬坡試驗設計及試驗結果

2.3響應面分析優化結果

Box-Behnken試驗設計及結果見表7，數據通過Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸分析。所得回歸方程為：R=44.24+3.53A+0.21B-1.34C-2.28AB-0.075AC+0.90BC+0.35A2-4.72B2-0.52C2，回歸方程各項方差分析結果顯示，實驗選用模型高度顯著(prob>F值小于0.05，R2=0.928)，表明回歸方程擬合度較好，預測值與實驗值具有高度相關性；失擬項prob>F值大于 0.05，試驗誤差較小，變異系數(coefficient of variation，CV)為3.83%，說明模型的置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實的試驗值，此模型可用于重組大腸桿菌發酵生產別藻藍蛋白亞基的預測和分析，響應面曲面圖見圖1～圖3。

表7　Box- Behnken試驗設計及結果

各因素對響應值的影響并非簡單線性關系。圖 1 顯示，隨著pH增加，別藻藍蛋白(holo-SA-apcA-PEB)表達量提高較快，約在pH8.0 時，表達量最高，誘導溫度在18 ℃前呈上升趨勢，其后呈現下降趨勢；圖2中pH對重組蛋白表達量的影響與圖1相似，接種量的最優取值在4%附近；圖3所示，誘導溫度趨勢轉折點在19℃，接種量對表達量的影響與圖2一致。

表8　Box-Behnken試驗方差分析結果

圖1　pH和誘導溫度對重組別藻藍蛋白表達量的影響Fig.1　Effects of pH and induce temperature on expression of holo-SA-apcA

圖2　pH和接種量對重組別藻藍蛋白表達量的影響Fig.2　Effects of pH and inoculation quantity on expression of holo-SA-apcA

圖3　誘導溫度和接種量對重組別藻藍蛋白表達量的影響Fig.3　Effects of induce temperature and inoculation amount on expression of holo-SA-apcA

2.4模型驗證試驗

Design-Expert 8.0軟件預測結果顯示，當pH為8.0，誘導溫度為18.0 ℃，接種量為4%時，別藻藍蛋白的表達量為49.5 mg/L。在此條件下進行3次驗證性試驗，重組蛋白的表達量為52.3 mg/L，與預測值基本一致，表明此響應面模型與實際發酵情況具有高度擬合性。

3討論

本實驗通過Plackett-Burman試驗設計，篩選出pH、誘導溫度和接種量為發酵生產的顯著影響因素，利用最陡爬坡試驗確定的最高表達率的 3 種因素相應值作為響應面試驗的中心點，通過Box-Behnken實驗和Design-Expert8.0軟件分析，確定重組大腸桿菌表達holo-SA-apcA的二次多項數學模型，其顯著性、失擬項和純誤差等重要參數均表明此模型與真實發酵情況有較高的擬合度。優化后的發酵條件為：誘導溫度18 ℃、發酵培養基初始 pH 8.0、接種量4%，在此條件下發酵得到的重組別藻藍蛋白(holo-SA-apcA-PEB)重組蛋白的表達量為52.3 mg/L，與軟件預測值相對誤差為 5.66 %，說明響應面優化得到的模型與試驗數據擬合度較好，達到了優化重組別藻藍蛋白發酵條件的目的。

任何生物化學的酶促反應都是與溫度變化有關的，根據酶促反應的動力學來看，隨著溫度的上升，反應速度加快，呼吸強度增加，細胞生長繁殖加快。但隨著溫度的持續上升，酶失活的速度也越大，使衰老提前，發酵周期縮短，這對發酵生產是及其不利的[10]。另一方面，隨著溫度升高，氣體在溶液中的溶解度減小，故溫度還可能通過影響氧在發酵液中的傳遞速率進而影響目的蛋白的合成。此外，誘導溫度根據目的蛋白大小、性質的不同而不同。因此，選擇合適的誘導溫度對于發酵生產目的蛋白(holo-SA-apcA)至關重要，本研究確定該蛋白的最佳誘導溫度為18 ℃，相對于有機體多數酶的最適溫度，該溫度較低，這可能是低溫能夠減少不必要的代謝反應，增加外源蛋白的正確組裝和折疊等[11]。發酵培養基 pH 值對菌體的生長和產物的表達均存在一定的影響，因為乙酸是大腸桿菌的主要副產物，它對其生長和產物的表達都有抑制作用[12]，本文通過試驗得到重組大腸桿菌的最適生長pH為 8.0，該值高于常規大腸桿菌培養(pH 7.0)，較高的初始 pH 值對重組大腸桿菌菌體生長過程中產生的乙酸存在一定的調節作用，從而利于菌體的生長與目的蛋白的表達。培養基的 pH 還將影響酶分子和底物分子的帶電狀況，從而影響酶的合成，使代謝和細胞透性發生變化[10]。推測pH 值的增加可能導致細胞膜通透性的增大，從而有利于誘導劑 IPTG進入到細胞內發揮誘導效應，目的蛋白轉錄水平得到加強。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例，接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧不足，影響產物合成，積累代謝廢物，過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。本文實驗獲得重組大腸桿菌的最佳接種量為4%。說明4%的接種量既可縮短發酵罐中菌體繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，又可保證溶氧和營養，避免積累過多代謝廢物。

綜上所述，利用Design-Expert軟件，確定了影響重組大腸桿菌產鏈霉親和素標記的別藻藍蛋白(holo-SA-apcA)因素，優化了重組大腸桿菌的發酵條件，本研究為SA-apcA的規模化生產和應用研究奠定了基礎。

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Optimization of fermentation conditions for production of recombinantallophycocyanin(holo-SA-apcA)fromEscherichiacoli

YANG Yu-ying1, CHEN Hua-xin2,3*, XU Yun-feng4, JIANG Peng2,3,ZHAO Jin2,3, CHEN Liang1*

1(School of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361102,China)2(Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China)3(Laboratory for Marine Biology and Biotechnology,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266071，China)4(Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266555, China)

ABSTRACTThe fermentation condition of E. coli for holo-SA-apcA production was optimized. Design-Expert software was used to evaluate the effects of eight factors. Three factors playing important roles, including pH, induction temperature and inoculation quantity, were screened out. Then the steepest ascent path was employed to determine the optimal region for holo-SA-apcA production. The regression analysis was further undertaken by using Box-Behnken design and response surface analysis. The highest holo-SA-apcA production was obtained at pH 8.0, induction temperature of 18 ℃,and inoculation quantity of 4%. The validation experiments showed production of 52.3 mg/mL, which was similar to the predicted value.

Key wordsallophycocyanin;E. coli；Plackett-Burman design; optimization

收稿日期：2015-07-17，改回日期：2015-12-11

基金項目：國家海洋公益性行業科研專項經費項目(201205027-2)；863計劃項目(2014AA093505，2014AA093501)；國家自然科學基金(41276164)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603028

第一作者：碩士研究生(陳華新、陳亮教授為通訊作者，chenhx001@126.com, chenlg@xmu.edu.cn.)。