葡萄酒釀造過程中12種殘留殺菌劑的歸趨追蹤

王玉路，王宗義，賈昌喜，姜懷璽，李德美，楊曼

(北京農學院 食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量安全北京實驗室，北京北農葡萄酒工程技術中心，北京，102206)

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葡萄酒釀造過程中12種殘留殺菌劑的歸趨追蹤

王玉路，王宗義*，賈昌喜，姜懷璽，李德美，楊曼

(北京農學院 食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量安全北京實驗室，北京北農葡萄酒工程技術中心，北京，102206)

摘要追蹤了葡萄酒釀造過程中12種殘留殺菌劑的歸趨，為葡萄酒殘留控制提供了有實用價值的數據。結果表明，各殺菌劑的酒渣殘留分量為41.63%～95.91%，平均為66.08%； 酒泥殘留分量為1.25%～21.40%，平均9.54%； 降解分量為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中酒精發酵期無降解，二次發酵期降解分量為2.09%～17.62%，平均為10.82%，陳釀期(陳釀3個月時)降解分量為0.84%～23.46%，平均為6.42%；酒汁中各殺菌劑的平均殘留分量最低，為7.14%，各殘留分量分別為多菌靈20.56%、甲霜靈14.32%、精甲霜靈9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰嗎啉6.49%、氟環唑2.66%、戊唑醇2.33%、氟硅唑1.71%、咪鮮胺0.40%、吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55 %，且與其logP值顯著負相關，脂溶性越強，葡萄酒中的殘留分量越小。

關鍵詞殺菌劑殘留;葡萄酒;釀造;歸趨追蹤

伴隨我國葡萄酒消費量的不斷提升[1]和葡萄酒產業的快速發展[2-3]，葡萄酒的質量安全和品質也越來越受到人們的重視。農藥殘留就是被關注的問題之一，它不僅影響影響葡萄酒的質量安全，還會對感官質量帶來不良影響[4]。目前，我國無論是葡萄，還是葡萄酒，在農藥殘留的控制方面，同國際葡萄酒主產國相比，都相對滯后[5-6]。

關于葡萄酒釀造過程中農藥歸趨行為的研究，是指導葡萄園合理使用農藥，改進釀造工藝，從而最大限度減少酒體中的農藥殘留，獲得高品質葡萄酒的重要依據。研究表明，釀造過程中，葡萄中的殘留農藥在液固兩相進行重新分配，更傾向吸附于酒渣和酒泥[7-9]，再加之釀造過程中的降解[10]，使得殘留于酒汁中農藥較葡萄原樣顯著減少。盡管這些歸趨行為已基本清楚，但不同性質的農藥，其殘留轉移到酒汁的分量并不相同[11]；又因受用藥品種、用藥歷史和環境特點的影響，不同國家、不同地域葡萄的農藥殘留情況也不相同。本文根據實驗室對葡萄樣品的農藥篩查分析結果，選擇12種經常檢出的殺菌劑，使用液相色譜-串聯質譜技術，對其實際殘留進行了釀造追蹤分析，以期為葡萄酒的農藥殘留控制提供具有實用價值的數據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

玫瑰香葡萄，購自北京昌平區回龍觀城北市場； Zymaflore F15酵母菌、果膠酶和酵母營養劑，法國Laffort公司。

固相萃取小柱，Cleanert NH2，500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司；50 mL塑料離心管，BD Bioscience公司。

各種殺菌劑(見表1)定值標準品，質量濃度為100 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；色譜乙腈、甲醇和甲苯，Burdick & Jackson, Honeywell公司；色譜級甲酸、乙酸，分析純無水硫酸鈉、6%亞硫酸、無水硫酸鎂和無水乙酸鈉，北京化學試劑公司。

1.2儀器設備

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS系統，Zorbax SB-C18色譜柱(3.5 μm，150 mm×2.1 mm)，美國安捷倫科技有限公司；AWL-1002-U艾科浦超純水系統，重慶順洋企業發展有限公司；BT125D電子天平(0.1 mg)，賽多利斯公司；FSH-2可調高速勻漿機，常州國華電器有限公司；IKA-MS3渦旋混合器，德國伊卡公司；BF-2000氮氣吹干儀，北京八方科技有限公司；旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；H1850R離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3葡萄酒釀造與取樣

取9 kg經去梗、挑去腐爛和破損籽粒的葡萄，于20 L不銹鋼發酵桶中，用不銹鋼攪拌棒搗碎。加入9 mL 6 %的亞硫酸溶液混勻，再分別加入0.27 g果膠酶和4.5 g酵母(酵母需提前經37 ℃活化，加葡萄汁培養15 min)攪拌均勻，進行酒精發酵(約7 d)。每天攪拌1次，并測定發酵液的密度，待葡萄汁密度下降到0.995 g/cm3時，發酵完成。將發酵液通過紗布過濾到20 L廣口瓶中，蓋好蓋子，自然啟動二次發酵(蘋果酸-乳酸發酵)，約10 d左右發酵完成。分離酒泥后，酒液裝瓶，加入2滴亞硫酸溶液后，打塞，置于酒窖陳釀。釀造實驗進行2個重復。

分別于發酵前采集葡萄樣本，于酒精發酵開始、中間、結束時，以及二次發酵結束時，采集漿液和酒汁樣本；于酒精發酵和乳酸蘋果酸發酵結束時采集酒渣和酒泥樣本。葡萄和酒渣樣本裝于塑料樣品袋中，發酵液和酒泥樣本分裝于50 mL離心管中，所有樣本冷凍保存(-18 ℃)。

1.4分析方法

參照GB/T 23206—2008[12]進行。樣品經室溫解凍后，稱取10 g(精確到0.000 1 g)樣品于50 mL螺口塑料離心管中(其中葡萄和酒渣需打漿破碎均勻后取樣)，準確加入10 mL含體積分數為1%乙酸的乙腈溶液，旋緊蓋子，渦旋混合2 min；再加1 g無水乙酸鈉，振蕩1 min，加4 g無水硫酸鎂，振蕩2 min，4 200 r/min離心5 min。

將氨基固相萃取柱中裝入高約為2 cm經650 ℃脫水4 h的無水硫酸鈉，用5 mL乙腈甲苯溶液(3+1，v/v)活化后，移取上述離心清液5.00 mL于小柱上，用25 mL乙腈甲苯溶液(3+1, v/v)洗脫，洗脫液于40 ℃減壓濃縮至約0.5～1 mL，再于35 ℃下氮氣吹干，用1 mL乙腈水溶液(3+2，v/v)復溶，再經0.22 μm濾膜過濾于進樣瓶中，于國標法給定的分析條件下進行色譜分離和質譜檢測。

2結果與討論

2.1葡萄樣本中12種殺菌劑的定量結果

根據實驗室對葡萄樣品的農藥篩查結果，選擇12種常被檢出的殺菌劑，對本次實驗用的葡萄樣本進行檢測，結果見表1，該12種殺菌劑均被檢出，但含量遠遠低于國家食品安全限量，這一定程度上也說明市場上的葡萄農藥殘留水平是安全的。該12種殺菌劑均為登記可用于葡萄的常用農藥品種，其中多菌靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉、吡唑醚菌酯和腐霉利，有相對較高的殘留量。

表1　葡萄中12種殺菌劑的測定結果

2.2葡萄酒釀造過程中各殺菌劑的追蹤

不同釀造階段，12種殺菌劑殘留量的定量追蹤結果見表2，其中甲基硫菌靈在釀造各階段的樣品中均未檢出(以下不再做討論)。酒精發酵開始時，發酵液中目標殺菌劑的含量明顯低于其在葡萄原樣中的含量，這是因為發酵液中不包含葡萄表皮和籽的緣故；在酒精發酵階段各農藥沒有觀察到明顯的下降趨勢，其中嘧霉胺、吡唑醚菌酯等的濃度還有上升的趨勢，這可能是表皮和籽中這2種殺菌劑隨著發酵時間的延長逐漸釋放到發酵液中造成；酒精發酵結束后的酒渣和二次發酵發結束后的酒泥中目標農藥都極顯著高于相應發酵液和酒汁；陳釀3個月的酒汁中目標農藥與二次發酵結束時相比，目標農藥也有顯著下降趨勢。

2.3葡萄酒釀造過程中各殺菌劑的殘留歸趨分析

由于不同葡萄品種和不同成熟度，酒汁、酒渣和酒泥的質量分數各不相同，本實驗使用的發酵過程中酒汁、酒渣和酒泥的質量分數約為0.8,0.1和0.1。由表2可知，酒精發酵階段發酵液中的目標殺菌劑沒有明顯的降解趨勢；酒精發酵結束后，根據酒渣和發酵液(酒漿)中目標殺菌劑的含量計算得到的殺菌劑總量與葡萄原樣中的殺菌劑總量相當，說明酒精發酵期殺菌劑降解不明顯，與CABONI等[9]的報道相一致；同樣根據蘋果酸-乳酸發酵結束時酒泥和酒汁中目標殺菌劑含量計算獲得的總量，明顯低于與發酵開始時酒漿中殺菌劑總量，說明蘋果酸-乳酸發酵期目標殺菌劑存在明顯的降解；陳釀期(3個月)也觀察到目標殺菌劑有明顯的降解。

表2　不同發酵階段發酵液中12種殺菌劑殘留的監測結果

注：1)本實驗數據的偏差小于15%，不再一一列出；2.ND 未檢出。

因此，為消除測定誤差的影響，可近似用酒精發酵期發酵罐中(酒渣和發酵液)各殺菌劑的總量為基礎，對整個釀造過程農藥歸趨進行分析，見表3。

表3　釀造過程中各殺菌劑的歸趨

注：目標農藥總濃度 (μg/kg) = 發酵液中目標農藥濃度(酒精發酵期)× 0.90 + 酒渣中目標農藥濃度× 0.10；

酒渣中的殘留分量(%) = 酒渣中目標農藥濃度×0.10 / 目標農藥總濃度×100；

酒泥中的殘留分量(%) = 酒泥中目標農藥的濃度×0.10/目標農藥總濃度×100；

酒汁中的殘留分量 (%) = 酒汁中目標農藥的濃度(陳釀結束時) × 0.80/目標農藥總濃度×100；

農藥總降解分量(%) = 100-酒渣中目標農藥的殘留分量(%)-酒泥中目標農藥的殘留分量(%)-葡萄酒中目標農藥的殘留分量(%)；

二次發酵期降解分量(%) ={發酵液中目標農藥濃度(酒精發酵期) × 0.90-酒汁中目標農藥的濃度(二次發酵結束)× 0.80-酒泥中目標農藥的濃度 × 0.10}/目標農藥總濃度× 100;

陳釀期降解分量(%) = 農藥總降解(%)-二次發酵期降解分量(%)。

結果表明，酒汁中殺菌劑的殘留分量為0.40%～20.56%，平均為7.14%，其中多菌靈、精甲霜靈、甲霜靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉和腐霉利有相對較高的殘留分量，這解釋了多菌靈等殺菌劑易于葡萄酒中檢出的原因；雖然酒泥中目標殺菌劑的濃度較高，但由于酒泥的質量分數小，其中的殺菌劑殘留分量只占1.25%～21.40%，平均為9.54%；殺菌劑的降解主要發生在二次發酵期和陳釀期，到陳釀3個月時殺菌劑降解總分量為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中二次發酵期殺菌劑殘留降解2.09%～18.17%，平均為10.82%。酒渣是殘留殺菌劑的最主要去向，為41.63%～95.91%，平均為66.08%。

雖然殺菌劑降解分量和酒泥中殺菌劑殘留分量都相對較小，但在去除酒渣后，通過酒泥沉淀可去除剩余殺菌劑(發酵液中)平均超過30%(依表3計算)，再通過陳釀期的進一步降解，陳釀3個月時可再去除剩余殺菌劑平均超過50%(依表3計算)，因此，通過酒泥沉淀和適當的陳釀可近一步有效去除葡萄酒中的農藥殘留。工業釀酒，通常還會加入澄清劑，其中用木炭和做澄清劑時，還會有效吸附部分農藥[7],關于使用澄清劑本文不作討論。

酒汁中殺菌劑的殘留水平，除決定于其葡萄的殘留水平外，還主要取決于其酒汁的殘留分量。將表3中的lgP值與酒汁中相應殺菌劑的殘留分量進行回歸，還可觀察到兩者之間呈顯著的負相關(R2=0.667)，見圖1，lgP值越大，即脂溶性越大，酒汁中對應殺菌劑的殘留分量越小，因此可通過殺菌劑lgP值的大小，對其酒汁的殘留分量進行判斷，這也為指導葡萄園合理用藥提供了直觀的依據。

3結論

本研究通過對葡萄樣品進行殺菌劑的測定和釀造實驗，對檢出的12種常用殺菌劑進行追蹤分析，為葡萄酒中的農藥殘留控制提供了具有實用價值的數據。研究表明， 葡萄中檢出的12種殺菌劑， 除含量較低的甲基硫菌靈之外，其他在釀造的各個階段均有檢出；各殺菌劑酒渣殘留為41.63%～95.91%，平均為66.08%，是主要去向；其次是釀造過程的降解，為2.43%～40.45%，平均為17.24%，其中在酒精發酵期沒有觀測到明顯降解，降解主要發生在二次發酵期和陳釀期；再次是酒泥中的殘留，為1.25%～21.40%，平均9.54%；酒泥的沉淀，二次發酵和陳釀期降解，在酒渣分離后進一步去除發酵液中的殺菌劑殘留發揮重要作用；酒汁中殺菌劑的平均殘留最低，僅為7.14%，酒汁中各殺菌劑的殘留分量分別為，多菌靈20.56%、甲霜靈14.32%、精甲霜靈9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰嗎啉6.49%，氟環唑2.66%，戊唑醇2.33%，氟硅唑1.71%，咪鮮胺0.40%，吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55；酒汁中殺菌劑的殘留分量與其logP值顯著負相關，脂溶性越強，葡萄酒中的殘留分量越小。

圖1　殺菌劑lgP值與其酒汁中殘留分量的關系Fig.1　The correlation between of the residues fraction of fungicides and their lgP values

參考文獻

[1]中國企業評價協會.中國成世界葡萄酒消費大國未來5年翻翻[J]. 中國產業經濟動態，2013(12)：3-4.

[2]王聰慧.中國葡萄酒現狀及未來發展趨勢的分析[J]. 市場周刊(理論研究)，2013(3)：47-48.

[3]小小.中國葡萄酒產量躍居世界第六[J]. 釀酒科技，2013(7)：120.

[4]李記明,司合蕓，于英，等.葡萄農藥殘留及其對葡萄酒釀造的影響[J].中國農業科學，2012,45(4):743-751.

[5]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，中華人民共和國農業部. 食品安全國家標準GB 2763-2014食品中農藥最大殘留限量[S]. 北京: 中國標準出版社，2014.

[6]食品伙伴網農獸藥數據庫. http://db.foodmate.net/pesticide(2014-12-15).

[7]CABRAS P, ANGIONI A. Pesticide residues in grapes, wine, and their processing products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(4):967-973.

[9]GARAU V L, ABREU S D M, CABONI P, et al. Residue-free wines: fate of some quinone outside inhibitor (Qoi) fungicides in the winemaking process[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 2 329-2 333.

[10]CABONI P, CABRAS P. Pesticides' influence on wine fermentation[J]. Advances in Food and Nutrition Research, 2010, 59: 43-62.

[11]薛潔，張敬，梁萌萌，等. 葡萄酒中農藥殘留的調查研究[J]. 釀酒科技, 2014(7): 4-8.

[12]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. 中華人民共和國國家標準，GBT 23206-2008 果蔬汁、果酒中512種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

Fate tracing for 12 residual fungicides in grapes during vinification process

WANG Yu-lu, WANG Zong-yi*, JIA Chang-xi，JIANG Huai-xi,LI De-mei, YANG Man

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Capital Wine Technology & Engineering Center, College of Food Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

ABSTRACTThe fate of 12 residual fungicides detected in grapes was traced during vinification process and useful data were provided for the control of fungicides residues in wines. Results showed that fractions of residues in cakes and lees for all fungicides were from 41.63% to 95.91% with an average of 66.08% and from 1.25% to 21.40% with an average of 9.45%, respectively. Fractions of degradation were from 2.43% to 40.45% with an average of 17.24%. Degradation was not observed for all fungicides during alcoholic fermentation, while it occurred mainly during the malolactic fermentation about 2.09%-17.62% with an average of 10.82% and during the storage about 0.84% to 23.46% with an average of 6.42%. The contents of residual fungicides in wine were 20.56% for carbendazim, 14.32% for mefenoxam, 9.34% for metalaxyl, 7.15% for pyrimethanil, 6.49% for dimethomorph, 2.66% for epoxiconazole, 2.33% for tebuconazole, 1.71% for flusilazole, 0.40% for prochloraz, 1.00% for pyraclostrobin, and 12.55 % for procymidone, The lowest average value was 7.14%. Significant negative correlation was observed between the fractions of residual fungicides in wine for and their logP values, which meant that the higher logP value the lower content of residual fungicides in wine.

Key wordsfungicides residues; wine; vinification; fate tracing

收稿日期：2015-02-14，改回日期：2015-04-14

基金項目：北京市教委項目(KM201310020009；PXM2014-014207-000001)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603020

第一作者：碩士研究生(王宗義副教授為通訊作者，E-mail：wangzongyi001@sina.com)。