動物雙歧桿菌乳亞種BZ11的耐氧馴化及降膽固醇性能的研究

王猛，熊江，張玲，李翠芹,何臘平,3*，陳平，范勁

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)　2(貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)　3(貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽，550025)　4(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽，550025)　5(貴州大學理學院，貴陽，550025)

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動物雙歧桿菌乳亞種BZ11的耐氧馴化及降膽固醇性能的研究

王猛1,2，熊江1,3，張玲1,2，李翠芹4,何臘平1,2,3*，陳平5，范勁1

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)3(貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽，550025)4(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽，550025)5(貴州大學理學院，貴陽，550025)

摘要為了提高動物雙歧桿菌乳亞種BZ11對有氧環境的耐受性，采用逐漸增加培養基中的氧分壓和有氧、厭氧條件下交替培養兩種方案對其進行了耐氧馴化。通過對馴化前后菌株的生長特性進行分析得出逐漸增加培養基中的氧分壓的馴化方案取得了更好的效果。經最優方案馴化后的菌株在有氧條件下培養20 h后，活菌數可達到6.30×108 CFU/mL，是初始菌株的2.24倍。馴化后菌株的降膽固醇率為27.31%± 0.80%，與初始菌株相比沒有顯著性差異(P>0.05)。通過鑒定得出，動物雙歧桿菌乳亞種BZ11在耐氧馴化前后保持了相似的形態及生理生化特征。因此，馴化后的菌株有望作為1株潛在益生菌被開發利用。

關鍵詞雙歧桿菌；耐氧馴化；降膽固醇；鑒定

雙歧桿菌是一種專性厭氧、不運動、不產芽孢的革蘭氏陽性桿菌，其染色不規則[1]，最早是由法國巴斯德研究所的HENRY于1899年從母乳喂養嬰幼兒的糞便中分離得到[2]，后來發現其廣泛存在于人和動物的腸道、女性生殖道、反芻動物的瘤胃等環境中，是母乳喂養嬰幼兒腸道的主要微生物[3]。

雙歧桿菌作為一種能夠定植腸道的微生物，已被證實可以通過多種機制對人體健康產生有益的影響[4]。最近，它們的降膽固醇特性已經引起了人們的廣泛關注[5]。目前，已經有不少體內實驗報道服用含一定數量益生菌的產品能夠有效降低人體系統中的膽固醇水平和血脂濃度，這對由高血清膽固醇而引起的人類心腦血管疾病的治療是一個利好消息[6]。通常采用傳統藥物對心腦血管疾病進行治療時，收效甚微，且副作用較大；而雙歧桿菌可通過同化吸收和菌體吸附等多種機制有效清除腸道中的膽固醇，降低人體對其的吸收利用，不產生有害代謝產物，且不影響人體對其他營養物質的吸收利用[7]。

然而，多數雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，當將其作為功能性成分添加到食品中時，由于周圍環境中氧化壓力的存在，不可避免的會對其活菌數及益生特性產生影響，而人們在消費時通常選擇和接受的產品所含的益生菌活菌量為106個/g[8]，這給雙歧桿菌的實際應用帶來了較多不便。經研究發現，有些專性厭氧菌株經人工耐氧馴化后可以在有氧的環境中生長。目前，國內外學者從多方面對雙歧桿菌的耐氧機理進行了探討，并采用不同的方法對雙歧桿菌進行了耐氧馴化，如逐漸增加培養基中的氧分壓[9]，在有氧和厭氧環境下交替培養[10]，進行物理或者化學方法誘變[11]，原生質體融合及基因轉導技術[12]等，這些方法起到了較好的馴化效果。

本實驗室從香豬源篩選得到1株動物雙歧桿菌乳亞種BZ11(CGMCC No.10224)，經實驗發現該菌株在耐氧馴化前具有一定的降膽固醇能力，為了進一步提高菌株的耐氧能力，本研究采用逐漸增加培養基中氧分壓和有氧、厭氧條件下交替培養兩種方案對該株菌進行了耐氧馴化，并考察其耐氧馴化后的生長及降膽固醇能力，為后期進一步研究該株菌的高密度發酵和實際應用奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

菌株BZ11為本實驗室從貴州省特色資源小香豬腸道內溶物中篩選得到，并經中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)鑒定為動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)，保藏編號為：CGMCC No.10224。

1.1.2雙歧桿菌的基礎培養基

PTYG培養基[13]：胰蛋白胨 5 g、大豆蛋白胨5 g、酵母粉10 g、葡萄糖10 g、吐溫80 1 mL、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g、鹽溶液4 mL、蒸餾水1 000 mL；調pH 值7.0，121 ℃，滅菌20 min。

鹽溶液配方：CaCl20.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.48 g、Na2CO310 g、NaCl 2 g、蒸餾水1 000 mL，溶解后備用。

降膽固醇培養基[14]：將膽固醇膠束加入到PTYG培養基中使其中含有膽固醇質量濃度為0.1 mg/mL。1 000 mL的液體培養基含0.1 mg/mL膽固醇膠束的制備：用分析天平準確稱取0.1 g膽固醇放入小燒杯中，然后依次稱取0.2 g膽鹽，0.1 g蔗糖八乙酸酯，1 mL吐溫80于小燒杯中攪拌均勻，然后移取5 mL的冰乙酸加熱溶解，超聲處理15 min后快速加入到液體PTYG培養基中，邊加入邊攪拌，最終使其形成均一穩定的膠體溶液，調pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3實驗設備

厭氧培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-185I水套式二氧化碳培養箱，上海三騰儀器有限公司；SPX型生化培養箱，上海科恒實業發展有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫療設備有限公司；SKY-100C恒溫搖床，上海百典儀器設備有限公司；SHHW2恒溫水箱，上海東星建材試驗設備有限公司；GBJS-5LS自動發酵罐，上海百侖生物科技有限公司；TGL 20M臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；海爾超低溫保存箱；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺，蘇凈集團；JM-A15002電子天平，余姚市紀銘稱重校檢設備有限公司；CX21FS1型OLYMPUS顯微鏡，奧林巴斯中國有限公司；pH計，上海鴻蓋儀器設備公司；T6新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養方法

將在-80 ℃低溫冰箱里甘油保藏的菌種管取出，在37 ℃恒溫水箱快速解凍，然后采用PTYG 培養基進行活化，置于厭氧培養箱(CO2-5%，H2-10%，高純N2-85%)37 ℃培養48 h，挑取單菌落進行劃線純化[13]，取同批次活化后的初始菌株進行耐氧馴化。

1.2.2菌體形態觀察

采用革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢法[15]。

1.2.3菌體OD600值的測定

利用可見分光光度計, 以未接種的PTYG液體培養基為空白對照，在600 nm 波長下進行光電比濁測定，記錄光密度值[15]。

1.2.4活菌數的測定

采用平板菌落計數法[15]。

1.2.5pH 值的測定

三角瓶實驗利用pH計進行測定，發酵罐擴大培養實驗通過發酵罐配套使用的pH電極進行測定，通過控制面板進行讀數。

1.2.6初始菌株生長能力測定

將經厭氧培養箱活化后的初始菌株在PTYG平板上進行多次劃線純化后，挑取單菌落到37 ℃生化培養箱進行培養，32 h后按2%的接種量進行液體傳代培養1次，每隔4 h取樣測定菌株在培養32 h生長過程中的吸光值，活菌數及pH的變化情況，繪制生長曲線。

1.2.7雙歧桿菌的耐氧馴化及生長能力測定

1.2.7.1耐氧馴化方案一

通過逐漸增加液體培養基中氧分壓的方案進行馴化。首先，在無菌條件下挑取純化培養后的初始菌株單菌落接種到PTYG培養基在20% CO2培養箱進行培養；然后，采用2%的接種量在20% CO2培養箱進行傳代培養，連續傳代5次后轉到生化培養箱培養；最后，在轉速為150 r/min的搖床上振蕩培養[9]。每次培養時間均為32 h，培養溫度均為37 ℃，所采用的培養裝置為250 mL帶棉篩三角瓶，裝液量為50 mL。馴化完畢后，測定菌株在生化培養箱中培養32 h過程中的生長狀況。

1.2.7.2耐氧馴化方案二

通過在厭氧和有氧條件下交替培養的方案進行馴化。首先，在無菌條件下挑取純化培養后的初始菌株單菌落接種到PTYG培養基在20% CO2培養箱進行培養，32 h后挑取菌懸液在PTYG平板上劃線培養；然后，挑取單菌落接種到PTYG培養基在生化培養箱培養，按此方法在20% CO2培養箱和生化培養箱中交替培養10次，之后完全在生化培養箱中進行傳代培養5次[10]。所采用的培養裝置同上。馴化完畢后，測定菌株在生化培養箱中培養32 h過程中的生長狀況。

1.2.8耐氧馴化前后菌株的形態及生理生化鑒定

觀察菌株在耐氧馴化前后進行有氧培養時的菌落形態，挑取單菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體形態，并采用雙歧桿菌生化鑒定管對耐氧馴化前后的菌株進行生理生化鑒定。

1.2.9耐氧馴化后菌株發酵罐擴大培養生長性能測定

將經最優馴化方案馴化的菌株在5 L發酵罐進行擴大培養，接種量為2%，培養溫度為37 ℃，轉速150 r/min，培養基初始pH 7.0。每隔4 h從發酵罐中進行取樣，測定菌株在培養48 h生長過程中吸光值，活菌數及pH的變化情況，繪制生長曲線。

1.2.10耐氧馴化前后菌株的降膽固醇能力的測定。

將耐氧馴化前后的菌株活化并純化培養3次后，挑取單菌落接種到PTYG培養基中在20% CO2培養箱中靜置培養48 h后，分別將菌液在10 000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，調整菌濃度后按10%的接種量接種于降膽固醇培養基中，在20% CO2培養箱中培養48 h后參照鄰苯二甲醛法(OPA)[14]測定菌株在耐氧馴化前后的降膽固醇能力。

1.3數據分析

所有試驗均重復進行3 次，所得數據表示為均值±SD，運用Origin Pro7.5進行作圖，并用SPSS Statistics 19進行統計學分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果與分析

2.1動物雙歧桿菌的耐氧馴化

將經兩種方案耐氧馴化后的菌株及初始菌株分別按照2%接種量接種于有氧條件下進行培養。測定菌株在培養32 h生長過程中的OD600值、活菌數和pH值，繪制生長曲線并進行對比。結果如圖1，圖2和圖3所示。

圖1　耐氧馴化前后動物雙歧桿菌的生長過程OD600值變化的比較Fig.1　Time courses of OD600 values of oxygen-resistant and original strains

圖2　耐氧馴化前后動物雙歧桿菌的生長過程活菌數變化比較Fig.2　Comparison of live bacterium number between oxygen-resistant and original strains

圖3　耐氧馴化前后動物雙歧桿菌的生長過程pH 變化的比較Fig.3　Time courses of growth pH of oxygen-resistant and original strains

由圖1，圖2，圖3及統計分析表明，與初始活菌數相比，菌株在耐氧馴化前后均可以在有氧條件下顯著生長(P<0.05)，菌株在培養4 h后便可以進入對數生長期(P<0.05)。按第一種方案馴化后的菌株在培養16 ～28 h處于穩定期(P>0.05)，在20 h處活菌數達到最大為6.30×108CFU/mL，培養液OD600值為0.938，pH值下降到3.38。按第二種方案馴化后的菌株也在培養16 h后進入穩定期，在20 h處活菌數達到最大為3.80×108CFU/mL，培養液OD600值為0.928，pH值下降到3.49。而未經過馴化的菌株，在培養4 h后進入快速增長期，8 h后進入緩慢增長期，28 h后進入衰亡期，在培養24 h后活菌數達到最大為2.82×108CFU/mL，此時培養液OD600值為0.923，pH值下降到3.54。對耐氧馴化前后的菌株在有氧條件下培養32 h過程中的達到的最大活菌數檢測結果及方差分析見表1、表2。

表1　不同方案馴化動物雙歧桿菌乳亞種BZ11的實驗結果

注：1) 標有同一字母的數據間差異不顯著；2) 方差分析采用Duncan新復極差法。

表2　不同方案馴化動物雙歧桿菌乳亞種BZ11

注：1)F0.05(2,6)=5.14；2) F0..01(2,6)=10.92；2) * *表示顯著性P<0.01。

由表1結果可知，經方案一馴化后的菌株活菌數最大，是馴化前初始菌株的2.24 倍。表2方差分析表明，幾種馴化方案馴化效果差異顯著。采用Duncan新復極差法可知，方案一與方案二差異顯著。另對最大活菌數對應的pH值分析表明，馴化后的菌株較馴化前產酸能力更強(P<0.05)。因此，確定方案一為最優馴化方案。

2.2耐氧馴化前后菌株形態及生理生化特征的比較

2.2.1形態特征

將耐氧馴化前后菌株在有氧條件下進行活化培養后進行平板稀釋涂布，觀察所長出的菌落的形態特征，挑取單菌落進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察菌體形態，對比結果如表3，圖4和圖5所示。

表3　耐氧馴化前后動物雙歧桿菌乳亞種BZ11形態特征

圖4　耐氧馴化前動物雙歧桿菌乳亞種BZ11菌體形態(×1000)Fig.4　Morphological photography of B. animalis subsp.lactis BZ11 before oxygen domestication

圖5　耐氧馴化后動物雙歧桿菌乳亞種BZ11菌體形態(×1000)Fig.5　Morphological photography of B. animalis subsp.lactis BZ11 after oxygen domestication

2.2.2耐氧馴化前后菌株的生理生化鑒定

采用雙歧桿菌生化鑒定管對耐氧馴化前后的菌株進行鑒定，鑒定管內液體呈黃色為陽性，如呈現紫色或紫灰色為陰性。鑒定結果如表4所示。

從表3、表4及圖4、圖5得出的菌株在耐氧馴化前后的形態及生理生化特征基本保持一致，所以確定菌株在耐氧馴化后沒有發生變異。

表4　耐氧馴化前后動物雙歧桿菌乳亞種BZ11的

注：表中“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應。

2.3馴化后菌株在發酵罐擴大培養生長能力的測定

將經第一種方案馴化后的菌株在5 L發酵罐中進行擴大培養，生長曲線如圖6所示。由圖6看出，在培養過程中馴化后的動物雙歧桿菌沒有明顯的延滯期，在培養4 h后便進入對數生長期，在24 h處活菌數達到最大為5.50×108CFU/mL，比初始活菌數顯著提高了近兩個數量級(P<0.05)。另外，OD600值在32 h處達最大為1.442，OD600值是活菌數和死菌數總體變化情況，所以最大OD600值時間與最大活菌數時間并不一致。

圖6　5 L發酵罐中耐氧馴化后動物雙歧桿菌BZ11發酵曲線圖Fig.6　Fermentation curve of domesticated B. animalis subsp.lactis BZ11 in 5L fermentor

2.4耐氧馴化前后菌株的降膽固醇能力的測定

按照OPA方法分別測定了耐氧馴化前后菌株在培養48 h后菌株降膽固醇率，耐氧馴化后菌株的降膽固醇率達到27.31%±0.80%，耐氧馴化前菌株的降膽固醇率為27.10%±0.92%，將菌株耐氧馴化前后的降膽固醇率進行t檢驗得出無顯著性差異(P=0.823>0.05)。因此得出，菌株在耐氧馴化前后降膽固醇能力并未受到較大影響。

3討論

本文研究結果表明當采用逐漸增加培養基中氧分壓對動物雙歧桿菌乳亞種BZ11進行耐氧馴化后，可以促進菌株更好地適應有氧環境。馴化后的菌株較馴化前在培養過程中推遲達到穩定期，且活菌數也有顯著提高。杜少平[9]也曾采用逐漸增加培養基中氧分壓的方法對兩歧雙歧桿菌進行耐氧馴化取得了較好的效果，與本研究的不同之處在于所采用的CO2濃度為5%，而本實驗過程中采用的CO2濃度為20%。KAZUAKI[16]曾采用不同的CO2濃度對長雙歧桿菌培養，發現了當CO2濃度為20%時，所獲得的細胞量和胞外多糖量均可達到最大。由此得出，適當增加CO2的濃度有助于厭氧菌株更好地進行生長和代謝。當然也有其他的馴化方案，如吳敏[17]曾采用了逐漸降低培養基中的抗氧化劑含量對嬰兒雙歧桿菌進行耐氧馴化，李麗[12]也成功運用了原生質體融合技術顯著改善了德氏乳桿菌的耐氧性。

關于雙歧桿菌的耐氧機制，國內外多位學者已對其進行了探討，TALWALKAR等[18]研究表明, 不同的氧氣濃度能促使雙歧桿菌的NADH 氧化酶活力和NADH過氧化物酶活力提高1.5～3倍，從而能抵制氧的毒性作用。然而KAWASAKI等[19]發現，NADH 氧化酶和NADH 過氧化物酶活力不是造成它們耐氧性差異的主要原因，并進一步研究表明：在pH 5.0～6.0時, 耐氧性高的雙歧桿菌的NADH 氧化酶以NADH-H2O 活性為主，而耐氧性低的雙歧桿菌的NADH 氧化酶以NADH-H2O2活性為主, 這表明NADH 氧化酶的類型也影響著雙歧桿菌的耐氧性。趙建云[20]研究了長雙歧桿菌在氧氣脅迫下菌體生長以及葡萄糖代謝中關鍵酶基因mRNA的變化情況，得出長雙歧桿菌耐氧性與葡萄糖代謝酶有一定關聯。左芳雷[21]曾對B.longum BBMN68的耐氧機制進行了探討，提到該菌對氧脅迫的應答是一個涉及到全基因組的全面而復雜的過程，包括一系列的抵御和適應性機制，進一步對其氧脅迫相應中的差異表達基因的功能進行驗證，得出AhpC是雙歧桿菌清除有氧產生的內源氧化物的主要酶類。關于本實驗所采用的動物雙歧桿菌所涉及到的耐氧機制有待進一步深入研究。

對經最優馴化方案馴化前后菌株的降膽固醇能力進行了測定，發現耐氧馴化前菌株的降膽固醇率為27.10%±0.92%，而耐氧馴化后菌株的降膽固醇率達到了27.31%±0.80%，菌株在耐氧馴化前后降膽固醇能力并沒有受到太大的影響。HOV等[22]曾研究發現干酪乳桿菌GL-03能夠明顯降低高血脂老鼠的總膽固醇和甘油三酯的水平，其中降膽固醇率能夠達到56.11%±3.58%。MUKESH等[23]曾對培養24 h后干酪乳桿菌和德氏乳桿菌的降膽固醇能力進行測定，發現降膽固醇率分別達到了22%和26%，后來用富含2株菌的飼料喂養小鼠發現能夠明顯降低小鼠血清總膽固醇水平而其他組織沒有發現病理性變化。而目前關于耐氧性能好且能降膽固醇的雙歧桿菌還少有報道。LYE[24]曾對5種乳酸菌在模擬腸道環境下降膽固醇的機制進行了研究，提到了5種主要機制分別是菌株生長過程中的同化吸收；細胞表面的黏附；膽固醇膠束的裂解；膽鹽的解離和酸性環境下膽鹽水解酶的酶解。關于何種降膽固醇機制起主導作用有待進一步深入研究。

將馴化后菌株在5 L發酵罐進行擴大培養，菌株在培養24 h后活菌數最高可達5.50×108CFU/mL，說明了馴化后的菌株在有氧條件下已具備一定的生長能力，且滿足雙歧桿菌揮益生作用的濃度。經形態學及生理生化鑒定得出馴化后的菌株較馴化前并未發生變異。在對其進行安全評價通過后有望被添加到食品制品中進行擴大生產和利用，從而能更好地滿足人們的生活需求。

參考文獻

[1]閆磊,王毳,曾慶祝,等.雙歧桿菌的功能特性及其應用前景[J].現代食品科技,2007,23(3):86-89.

[2]熊三玉,管斌,孔青,等.兩歧雙歧桿菌耐氧耐酸耐膽鹽優良菌株的選育[J].中國釀造,2007,26(6):32-35.

[3]NINOMIYA K,MATSUDA K, KAWAHATA T,et al. Effect of CO2concentration on the growth and exopolysaccharide production of Bifidobacterium longum cultivated under anaerobic conditions[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2009,107(5):535-537.

[4]NAGPAL R,KUMAR A,KUMAR M, et al. Probiotics, their health benefits and applications for developing healthier foods:a review[J].FEMS Microbiology Letters,2012,334(1):1-15.

[5]BORDONI A,AMARETTI A,LEONARDI A,et al. Cholesterol-lowering probiotics:in vitro selection and in vivo testing of bifidobacteria[J].Applied microbiology and biotechnology,2013,97(18):8 273-8 281.

[6]JONES M L,TOMARO-DUCHESNEAU C,MARTONI C J,et al. Cholesterol lowering with bile salt hydrolase-active probiotic bacteria,mechanism of action,clinical evidence,and future direction for heart health applications[J].Expert opinion on Biological Therapy,2013,13(5):631-642.

[7]國立東,楊麗杰,霍貴成.乳酸菌降膽固醇機制的研究進展[J].食品與發酵工業,2013,39(2):117-122.

[8]LACROIX C, YILDIRIM S. Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality[J].Current Opinion in Biotechnology,2007,18(2):176-183.

[9]杜少平,楊礎華,石笛,等.兩歧雙歧桿菌耐氧耐酸優良菌株的選育[J].現代食品科技,2009,25(8):916-919.

[10]韓雪,馮鎮,易華西,等.兩株雙歧桿菌的耐氧馴化及生長特性研究[J].食品科技,2010,35(9):37-40.

[11]MOZZETTI V, GRATTEPANCHE F, MOINE D,et al. New method for selection of hydrogen peroxide adapted bifidobacteria cells using continuous culture and immobilized cell technology[J].Microbial Cell Factories, 2010,9:60.

[12]李麗.利用原生質技術選育耐氧德氏乳桿菌菌株的研究[D].合肥：安徽農業大學, 2012.

[13]張剛.乳酸細菌:基礎,技術和應用[M].北京化學工業出版社生物.醫藥出版分社, 2007:427.

[14]張汝嬌,何臘平,李翠芹,等.鄰苯二甲醛法(OPA)與高效液相色譜法(HPLC)測定降膽固醇的雙歧桿菌的對比[J].食品與發酵工業,2014,40(7):177-181.

[15]劉國生.微生物學實驗技術[M].北京：科學出版社,2007,14-131.

[16]NINOMIYA K,MATSUDA K,KAWAHATA T,et al. Effect of CO2concentration on the growth and exopolysaccharide production of Bifidobacterium longum cultivated under anaerobic conditions[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2009,107(16):535-537.

[17]吳敏,胡穎,羅愛平,等.嬰兒雙歧桿菌的耐氧馴化及應用特性研究[J].食品與機械,2012,28(2):18-22.

[18]TALWALKAR A,KAILASAPATHY K.Metabolic and biochemical responses of probiotic bacteria to oxygen [J].Journal of Dairy Science,2003,86(8):2 537-2 546.

[19]KAWASAKI S,MIMURA T,SATOH T,et al. Response of the microaerophilic Bifidobacterium species,B. boum and B. thermophilum, to oxygen[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(10):6 854-6 858.

[20]趙建云,馬會勤,肖滿,等.氧氣脅迫對長雙歧桿菌葡萄糖代謝關鍵酶基因表達的影響[J].食品工業科技, 2011,32(10):220-224.

[21]左芳雷.長雙歧桿菌BBMN68氧脅迫應答機制的轉錄組學研究及差異表達基因的功能分析[D].北京：中國農業大學,2014.

[22]HOU H-M,GUO D-Q,ZHANG G-L,et al. Characteristics of cholesterol-lowering Lactobacillus casei subsp. casei strain GL-03 isolated from cheese[J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2014, 57(5):597-603.

[23]SINGH M K,SINGLA R,SINGH A,et al. Survival of probiotic strains in non-dairy indian spice condiment exhibiting cholesterol reducing properties[J].Food Science and Biotechnology,2012,21(5):1 309-1 315.

[24]LYE H-S, RAHMAT-ALI G R, LIONG M-T.Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[J].International Dairy Journal,2010,20(3):169-175.

Studies on oxygen domestication and cholesterol degradation property ofBifidobacteriumanimalissubsp.lactisBZ11

WANG Meng1,2,XIONG Jiang1,3,ZHANG Ling1,2, LI Cui-qin4,HE La-ping1,2,3*,CHEN Ping5,FAN Jin1

1(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)2(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store & Processing of Guizhou Province, Guiyang 550025,China)3(Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China)4(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)5(College of Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

ABSTRACTTo improve the aerotolerant capacity of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BZ11 in aerobic environment, two ways including gradual increase of the partial pressure of oxygen in medium and alternate incubation between aerobic and anaerobic were taken. After analyzing the growth characteristics of the strain pre- and post- domestication, the first method obtained a better effect and cell concentration of the domesticated strain reached 6.30×108 CFU/mL after cultivating in aerobic conditions for 20 h, which was 2.24 times of the concentration of the original strain. The cholesterol degradation rate of the strain after oxygen-domestication was 27.31%±0.80%, which didn’t show significant difference (P>0.05) compared with the original strain. Moreover, identification results indicated that the physiological and morphological characteristics of domesticated Bifidobacterium animalis subsp.lactis BZ11 kept similar to those of the original strain. So it can be used as a potential probiotics for further in-depth development and utilization.

Key wordsBifidobacterium; oxygen- domestication; cholesterol degradation; identification

收稿日期：2015-10-20，改回日期：2015-12-07

基金項目：國家自然科學基金(31160002)；貴州省豬肉制品工程技術研究中心項目(黔科合農G字[2013]4001號)；貴州省豬肉特色制品深加工關鍵技術研究及產業化示范(黔科合重大專項字[2015]6004號)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603001

第一作者：碩士研究生(何臘平教授為通訊作者，E-mail：helaping@163.com)。