復方麥芽丸對多囊卵巢綜合征大鼠雄激素受體及胰島素受體基因表達的影響

王爽 楊洋博君 蘭楠 陳蓉

摘要：目的 觀察復方麥芽丸對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠雄激素受體（AR）、胰島素受體（INSR）基因表達的影響，探討其相關作用機制。方法 采用來曲唑誘導建立PCOS大鼠模型。將大鼠隨機分為正常組、模型組、達英-35組及復方麥芽丸低、中、高劑量組。模型組和正常組給予生理鹽水灌胃，達英-35組給予達英-35灌胃，復方麥芽丸各劑量組給予相應濃度復方麥芽丸灌胃，連續21 d。ELISA檢測各組大鼠血清睪酮（T）、胰島素（INS）水平，RT-PCR檢測AR、INSR基因表達。結果 與正常組比較，模型組血清T、INS和AR、INSR基因表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，復方麥芽丸各劑量組血清T、INS水平和AR、INSR基因表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論 復方麥芽丸可糾正PCOS模型大鼠的內分泌-代謝失調狀態。

關鍵詞：復方麥芽丸；多囊卵巢綜合征；睪酮；胰島素；雄激素受體；胰島素受體；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0047-04

Effects of Compound Malt Pill on Gene Expressions of Androgen Receptor and Insulin Receptor in Polycystic Ovarian Syndrome Rat Models WANG Shuang， YANG Yang-bojun， LAN Nan， CHEN Rong （The Lab of TCM， College of Traditional Chinese Medicine， Chongqing Medicine University， Chongqing 400016， China）

Abstract： Objective To explore the effects of Compound Malt Pill on gene expressions of androgen receptor （AR） and insulin receptor （INSR） in polycystic ovarian syndrome （PCOS） rats； To discuss its relevant mechanism of action. Methods Letrozole was used to induce and establish rat models. Rats were randomly divided into normal group， model group， Diane-35 group， low-， medium- and high-dose Compound Malt Pill groups. The normal group and model group received normal saline by gavage； the Diane-35 group was given Diane-35 by gavage； Compound Malt Pill groups were respectively given different concentrations by gavage for 21 d. The levels of serum testosterone （T） and insulin were measured by ELISA， and the gene expressions of AR and INSR were measured by RT-PCR. Results Compared with normal group， the serum T， insulin and the gene expressions of AR and INSR in model group increased significantly （P<0.05， P<0.01）； compared with model group， the serum T， insulin and the gene expressions of AR and INSR in low-， medium- and high-dose Compound Malt Pill groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Compound Malt Pill can adjust endocrine-metabolic disorder in PCOS rats.

Key words： Compound Malt Pill； polycystic ovarian syndrome； testosterone； insulin； androgen receptor； INSR； rats

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）病機復雜、臨床表現多樣，是引起婦女無排卵性不孕常見的因素，而高雄激素血證和胰島素抵抗是引起婦女PCOS的主因[1-2]。復方麥芽丸是重慶醫科大學陳蓉教授治療PCOS的經驗方，臨床研究表明，復方麥芽丸能明顯改善PCOS患者的臨床癥狀[3]。本

基金項目：重慶市衛生局重點課題（渝中醫2013-54號）

通訊作者：陳蓉，E-mail：cr8093@126.com

實驗觀察復方麥芽丸對PCOS大鼠血清睪酮（T）、胰島素（INS）水平的調節作用及對卵巢雄激素受體（androgen receptor，AR）、胰島素受體（insulin receptor，INSR）基因表達的影響，探討其相關機制，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

6周齡清潔級健康SD雌性大鼠48只，體質量170～190 g，重慶醫科大學動物實驗中心，許可證號SCXK（渝）2012-0002。飼養于重慶醫科大學清潔級動物實驗室，自由攝食、飲水。

1.2 藥物及制備

復方麥芽丸（麥芽、熟地黃、山萸肉、巴戟天、肉蓯蓉、菟絲子、仙茅、桃仁、紅花、牡丹皮、當歸、澤瀉、知母、黃柏等），飲片均購自重慶醫科大學附屬大學城醫院大公館醫院中藥房，按常規中藥煎煮方法，先將中藥浸泡30 min，煎煮3次后，將濾液去渣濃縮，分別制成低（5.76 g/kg）、中（11.52 g/kg）、高（23.04 g/kg）劑量的湯劑，分裝，4 ℃冰箱保存。來曲唑，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號14030656，用前將來曲唑2.5 mg溶于1%羧甲基纖維素20 mL溶液中配成濃度為0.125 mg/mL藥液；炔雌醇環丙孕酮片（達英-35），拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號1407，用前研成粉末溶于蒸餾水，制成劑量為1.44 g/kg藥液。

1.3 主要試劑與儀器

T試劑盒（批號20150301）、INS試劑盒（批號20150301），北京博奧森生物技術有限公司；GAPDH及AR、INSR的PCR引物、反轉錄試劑盒，上海滬尚生物科技有限公司。倒置白光顯微鏡（日本Olympus公司），低溫離心機（SIGAM公司），Bio-Rad PCR擴增儀（上海拜力生物科技有限公司），移液槍、真空采血管（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.4 造模及分組

將配制好的來曲唑-羧甲基纖維素水溶液每日按8 mL/kg灌胃，參照文獻[4-5]建立PCOS大鼠模型。正常組每日給予1%羧甲基纖維素溶液8 mL/kg等量灌胃，共21 d。將造模成功大鼠隨機分為模型組、達英-35組和復方麥芽丸低、中、高劑量組。達英-35組給予達英-35灌胃，復方麥芽丸各劑量組給予相應濃度復方麥芽丸灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為1 mL/200 g。末次給藥后空腹1 d，3%戊巴比妥1 mL/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min低溫離心15 min，分離出的血清-80 ℃保存。分離雙側卵巢，一側裝于凍存管中，-80 ℃低溫保存備用；另一側則10%多聚甲醛溶液固定48 h，以作常規石蠟包埋切片。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠陰道涂片 于造模第14日進行連續2個發情周期的陰道涂片，觀察大鼠發情周期變化。用移液槍將100 μL無菌生理鹽水移入大鼠陰道，反復吹吸3～4次后，將吸出液涂布于清潔載波片上，伊紅染色后烘干玻片，中性樹脂封片并采集圖像。

1.5.2 ELISA檢測睪酮、胰島素水平 凍存血清于室溫平衡30 min，標準品按說明稀釋5個濃度梯度，96孔板中依次加入標準品和樣品、生物素標記二抗、鏈霉親和素-HRP，37 ℃孵育60 min，洗板5次，加入顯色液，37 ℃避光孵育10 min，加入終止液，酶標儀讀取OD值，根據標準品濃度和測量的OD值得出直線回歸方程，樣品所得OD值代入方程式即得出樣品濃度。ELISA檢測大鼠T、INS水平，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.5.3 RT-PCR檢測卵巢雄激素受體、胰島素受體基因表達 根據GenBank上所查mRNA序列設計引物，引物序列：AR上游5'CGGGCAAAGGCACTGAAG AGAC3'，下游5'GCGGGCGTGTGGATGGGTAG3'，產物長度263 bp；INSR上游5'CGGCCCGATGCT GAGAACAAC3'，下游5'CCCTTGCCCCCTTTCCG ATAG3'，產物長度233 bp；β-actin上游5'TGGTGG GAATGGGTCAGAAG3'，下游5'CTTCCTTAATGT CACGCACGATTTC3'，產物長度540 bp。提取凍存的大鼠卵巢總mRNA，反轉錄合成cDNA。PCR反應條件：94 ℃預處理5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環45次，72 ℃延伸10 min。采用Quantity One 4.6.2圖像分析系統對圖像進行分析，讀取的目標基因與β-actin之比即為各組卵巢組織AR、INSR基因的相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察大鼠動情周期

通過觀察陰道涂片結果，判斷大鼠動情周期。正常組大鼠可見規律動情周期，而造模成功后的大鼠可見動情周期紊亂或持續處于動情間期。

2.2 復方麥芽丸對模型大鼠血清睪酮、胰島素水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清T、INS水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，復方麥芽丸各劑量組血清T、INS水平明顯降低（P<0.05，P<0.01），達英-35組血清T水平明顯降低（P<0.01），而血清INS水平與模型組比較變化不明顯（P>0.05）；與達英-35組比較，復方麥芽丸低、中劑量組血清T水平明顯升高（P<0.05），復方麥芽丸高劑量組血清T水平與達英-35組相近，復方麥芽丸中、高劑量組血清INS水平明顯降低（P<0.05）。結果見表1。

2.3 復方麥芽丸對模型大鼠卵巢組織雄激素受體、胰島素受體基因表達的影響

模型組AR、INSR基因表達較正常組呈高表達（P<0.01），復方麥芽丸各劑量組AR、INSR基因表達較模型組明顯降低（P<0.01），達英-35組AR基因表達較模型組明顯降低（P<0.01），而INSR基因表達與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）；復方麥芽丸低、中劑量組AR基因表達較達英-35組呈高表達（P<0.05），復方麥芽丸各劑量組INSR基因較達英-35組呈現低表達（P<0.01）。結果見表2。

3 討論

PCOS病因病機比較復雜，其發病率可能受到地域、種族、飲食差異的影響。遺傳、環境、精神心理等因素既能誘發PCOS產生，又可加重該病的發展。目前建立PCOS動物模型日漸成熟，雄激素造模法、孕激素聯合HCG造模法、芳香化酶抑制劑來曲唑造模法等是當前公認的造模方法，它們所引起的PCOS在發病機理、組織形態和內分泌學方面均有差異。本實驗選用來曲唑誘導建立PCOS大鼠模型。研究表明，來曲唑誘導建立的PCOS大鼠模型的內分泌學、組織形態學的改變符合人類PCOS患者的卵巢形態學及內分泌學改變的特征[6]。

PCOS發生的主要因素主要有高雄激素血證和胰島素抵抗。雄激素是女性生殖發育過程所必須的重要激素之一，是雌激素合成的前體，通過與AR特異性結合而在卵泡發育、排卵、生殖過程中發揮作用。雄激素過高則會導致卵泡顆粒細胞的增殖、分化受到抑制，同時通過對芳香化酶發揮抑制作用，使卵巢雌、孕激素分泌降低，大量的AR是閉鎖卵泡增加、成熟卵泡減少的重要因素。研究表明，INSR是卵泡膜細胞分泌過多雄激素的重要因子，能促進卵巢AR的合成，引起高雄激素血癥[7]，高水平的INS可能會使卵泡顆粒細胞過早成熟，從而刺激卵泡膜細胞產生、分泌雄激素，同時通過降低性激素結合球蛋白水平，刺激雄激素生成[8-9]。INSR與PCOS具有高相關性，可增加PCOS患者發生代謝綜合征，如糖尿病、高血壓病、血脂異常、心血管疾病等風險，嚴重影響患者的健康[10]。

目前治療PCOS方面，西醫以降低雄激素水平、改善胰島素抵抗、促排卵為主，中醫則通過辨證論治、標本兼顧治療。復方麥芽丸具有補腎健脾、燥濕化痰、活血化瘀的功效，方中巴戟天、肉蓯蓉、菟絲子等補腎中藥可縮小囊狀擴張的卵泡，增加顆粒細胞、黃體數，減少閉鎖卵泡數，促進正常卵泡發育成熟，改善子宮內膜情況，還可降低含量，改善卵巢局部血流情況[11-13]。澤瀉等燥濕藥可降低血清T、雄激素、INS和慢性炎癥因子等水平，緩解胰島素抵抗，改善卵巢功能，恢復排卵[14]。桃仁、紅花等活血化瘀藥可擴張卵巢局部血管、促進局部血液循環，增加纖溶酶活性，抑制血小板凝聚，降低INS和雄激素水平，促進排卵[15]。實驗結果表明，復方麥芽丸能明顯降低血清T、INS水平，下調卵巢組織AR、INSR基因表達，并隨藥物劑量的增加，調節作用亦發生相應變化。同時通過與臨床治療PCOS常用藥物達英-35作用比較，顯示復方麥芽丸在治療PCOS的某些方面具有優勢。復方麥芽丸對血清激素T、INS及卵巢AR、INSR基因表達的調節作用，表明其治療作用的發揮可能是通過對T、INS、AR、INSR的調節進行的，其具體機制尚需進一步研究。

參考文獻：

[1] VITAL-REYES V S， CARRILLO-MARTINEZ C R， HINOJOSA-CRUZ J C， et al. Insulin resistance frecuency in women's with polycystic ovary syndrome using hyperinsulinemic-euglycemic clamp[J]. Ginecol Obstet Mex，2014，82（12）：785-790.

[2] DIAMANTI-KANDARAKIS E. Insulin resistance in PCOS[J]. Endocrine， 2006，30：13-17.

[3] 陳蓉，楊洋博君，令弧華.復方麥芽丸治療多囊卵巢綜合征83例臨床觀察[J].中醫臨床研究，2013，5（8）：82-83.

[4] 戴碎平，王永紅.復方甘芍貼劑對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢顆粒細胞膜間隙連接蛋白43表達的影響及意義[J].中國藥物與臨床，2015， 15（2）：178-180.

[5] 劉艷麗，賈莉婷，馬葆靖，等.來曲唑法建立PCOS大鼠模型的評價[J].中國婦幼保健，2011，26（8）：1213-1216.

[6] 李明明，潘文，康開彪.不同造模方法對大鼠多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗模型的影響[J].西部中醫藥，2015，28（4）：11-14.

[7] DU L T， HUANG J， HUANG L L， et al. Identification of differentially expressed microRNAs in the ovary of polycystic ovary syndrome with hyperandrogenism and insulin resistance[J]. Chinese Medical Journal，2015，128（2）：169-174.

[8] CORBOULD A. Effects of androgens on insulin action in women：is androgen excess a component of female metabolic syndrome[J]. Diabetes Metab Res Rev，2008，24（7）：520-532.

[9] ZHENG Y， STENER-VICTORIN， NG E H， et al. How does acupuncture affect insulin sensitivity in women with polycystic ovary syndrome and insulin resistance？ Study protocol of a prospective pilot study[J]. BMJ Open，2015，5（4）：e007757.

[10] EBRAHIMI-MAMAGHANI M， SAGHAFI-ASL M， PIROUZPANAH S， et al. Association of insulin resistance with lipid profile， metabolic syndrome， and hormonal aberrations in overweight or obese women with polycystic ovary syndrome[J]. J Health Popul Nutr，2015，33（1）：157- 167.

[11] 滕楊，韓鳳娟，王崇洋，等.補腎法治療不孕癥研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2015，17（1）：101-104.

[12] 劉奕.探討補腎中藥對卵巢儲備功能低下患者子宮卵巢血流指數的影響[J].醫學理論與實踐，2015，28（4）：495-496.

[13] 譚湘萍，潘智超，麥泳儀，等.補腎中藥改善IVF-ET周期卵巢儲備功能和子宮內膜容受性的Meta分析[J].中國現代應用藥學，2015，32（3）： 347-355.

[14] 李曉倩，沈山梅，畢艷，等.健脾化痰方對大鼠胰島素抵抗及慢性炎癥因子的影響[J].中華中醫藥學刊，2013，31（11）：2541-2544.

[15] 劉慧萍，肖藝，李玲，等.補腎活血方對卵巢早衰小鼠顆粒細胞凋亡的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2015，22（4）：47-50.