一株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

郝偉偉，胥燕芳，方鵬飛，廖韋萍

（四川省華派生物制藥有限公司，四川簡陽　641401）

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一株雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

郝偉偉，胥燕芳，方鵬飛，廖韋萍

（四川省華派生物制藥有限公司，四川簡陽641401）

摘要：本試驗采集某養雞場發病雞的腎臟和肺組織病料，接種雞胚盲傳，發現從F3代開始出現侏儒胚及發育不良的雞胚，經病毒血凝性測定、干擾NDV試驗、RT-PCR鑒定，判定該病毒為雞傳染性支氣管炎病毒，命名為HP-W株。對該分離株的S1基因進行擴增、測序，結果表明該毒株的S1基因長度為1620bp，與變異株4/91的核苷酸同源性為98.9%，氨基酸同源性為98.1%，與其他毒株核苷酸及氨基酸序列的同源性均低于80%。

關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒；分離；鑒定

雞傳染性支氣管炎（IB）簡稱雞傳支，是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，是家禽二類傳染病，也是危害世界養禽業最為嚴重的疫病之一。該病毒主要侵害雞的呼吸系統、消化系統以及泌尿生殖系統，造成雞咳嗽、噴嚏、氣管啰音、呼吸困難、腸炎、產蛋數量和質量下降等癥狀[2-3]。雞傳染性支管炎的臨床分型主要包括呼吸型、生殖型（又稱產蛋雞變異型）、腎型、腺胃型等，并不斷產生新的基因型[4]。IBV經常同大腸桿菌、NDV 及AIV混合感染雞群，混合感染后的病情比單一感染更加嚴重，常導致極高的發病率和死亡率，經濟損失嚴重[5-6]。本試驗從一混合感染禽流感H9亞型病毒的病料中分離得到一株傳染性支氣管炎病毒，現報告如下。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病料四川眉山市某大型養雞場21日齡商品肉雞群發生疫情。病雞主要表現為食欲下降，精神萎頓，張嘴呼吸、氣管有啰音；病情持續一周，雞群發病率約50%，死亡率約10%；剖檢后，大多數病死雞的支氣管內有黃色干酪樣栓塞。無菌采集發病雞的腎臟及肺組織作為病料保存。

1.1.2試驗動物SPF蛋和SPF雞購自濟南禽業科技有限公司，SPF蛋購買后由實驗室孵化，SPF雞飼養在隔離器中。

1.1.3 H9亞型禽流感陽性血清由哈爾濱獸醫研究所生產。

1.1.4新城疫LaSota株病毒購自中國獸醫藥品監察所，實驗室保存。

1.1.5生化試劑Trizo1 Reagent為Invitrogen公司產品；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產品；瓊脂糖購自GIBCO公司。

1.2試驗方法

1.2.1病料處理無菌取病料，剪碎，按1g∶5 mL加入滅菌PBS液（pH值7.2），在研缽中充分研磨，研磨后的病料凍融3次，以3 000r/min離心10min，取上清液經0.22μm濾器過濾。

1.2.2疾病診斷

1.2.2.1病毒繁殖及傳代。將處理好的病料上清液經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.1mL/胚，同樣的方法用PBS液接種雞胚作為陰性對照。接種后將雞胚置37℃溫箱中繼續孵育。每24h觀察雞胚1次，棄掉24h內死亡胚，收集120h內的死胚和部分活胚（4℃致死），收獲尿囊液（記為E1代）進行傳代。剩余活胚培養至144h，觀察雞胚病變。

1.2.2.2 HA試驗。按常規微量法對傳代尿囊液進行HA測定。

1.2.2.3 RT-PCR檢測。對有血凝性的尿囊液采用Trizo1法提取RNA，分別以H9亞型AIV、NDV、IBV特異性引物進行RT-PCR擴增，并對產物進行電泳，觀察結果。

1.2.3雞傳染性支氣管炎病毒分離取一定體積處理過的病料于管制瓶中，加入等體積H9亞型禽流感陽性血清，37℃中和1h。將中和的病毒液接種10日齡雞胚尿囊腔，0.2mL/胚，同樣的方法用PBS液接種雞胚作為陰性對照。接種后將雞胚置37℃溫箱中繼續孵育。每24h觀察雞胚1次，棄掉24h內死亡胚，收集36～48h內的死胚和部分活胚（4℃致死），收獲HA陰性尿囊液（記為F1代）進行傳代。剩余活胚培養至144h，觀察雞胚病變。

1.2.4雞傳染性支氣管炎病毒鑒定

1.2.4.1病毒血凝性測定。試驗共分為4組，A組：取F6代雞胚尿囊液，加1%胰酶；B組：取F6代雞胚尿囊液，不加胰酶；C組：取PBS液接種10日齡雞胚，48h收獲尿囊液加1%胰酶；D組：取PBS液接種10日齡雞胚，48h收獲尿囊液不加胰酶。四個試驗組均置于37℃下處理4h，然后按常規微量法測定紅細胞凝集價。

1.2.4.2干擾NDV試驗。將10日齡健康雞胚分為4組（分組情況見表1），接種后于37℃孵育72h，無菌收集尿囊液，按常規方法分別測定各組血凝（HA）滴度。

表1　干擾NDV試驗的雞胚分組

1.2.4.3 S1基因序列測定參照GenBank已經公布的IBV全基因組序列，在進行多序列比對分析的基礎上，利用IBV基因組S1基因兩端外的保守序列，應用Premier 5.0軟件設計一對引物，用于擴增包含IBV S1基因序列的一段約1 720 bp的序列。采用Trizo1法提取病毒RNA，用RT-PCR方法擴增S1基因，再進行電泳，切下目的片段后進行膠回收。將回收到的DNA片段送去英濰捷基生物公司進行基因測序，然后把測序結果同GenBank上的S1基因cDNA序列進行比對。

2　結果

2.1疾病診斷

2.1.1雞胚病變病料處理傳代后，第1代出現4枚死胚，其余活胚未觀察到明顯病變，從第3代開始出現侏儒胚及發育不良雞胚，符合雞傳染性支氣管炎典型病變，因此判定病料中含有雞傳染性支氣管炎病毒。

2.1.2 HA試驗結果E1代死胚及個別活胚尿囊液能夠凝集1%的新鮮雞紅細胞，E2代尿囊液均能凝集1%的新鮮雞紅細胞，凝集價為1∶28～1∶210。懷疑病料中含有新城疫或禽流感病毒。

2.1.3 RT-PCR檢測結果分別以NDV、H9亞型禽流感AIV、IBV特異性引物用RT-PCR法檢測尿囊液，電泳結果見圖1。圖中可見H9亞型AIV及IBV引物均擴增出特異性條帶，判定病料中含有H9亞型AIV及IBV。

2.2雞傳染性支氣管炎病毒分離F1代未見明顯病變，從F3代開始出現侏儒胚。傳至F6代，雞胚出現穩定病變，表現為：胚體發育明顯受阻，明顯小于正常雞胚，出現卷曲胚、矮小胚、羽毛發育不良；死亡雞胚有充血、出血的現象，死亡時間大多在72～120h，死胚尿囊液明顯增多，羊膜增厚，表面混濁，胚體發生蜷縮，趾爪緊抱頭部（見圖2）。尿囊液HA檢測均為陰性。將分離到的病毒命名為HP-W株。

圖1　病料RT-PCR檢測結果

圖2　雞胚病變

2.3雞傳染性支氣管炎病毒鑒定

2.3.1病毒血凝性測定結果病毒血凝測定結果見表2。結果顯示：F6代尿囊液血凝價為0，經1%胰蛋白酶處理后血凝價為71og2，PBS接種的雞胚尿囊液經胰酶處理及未經處理的血凝價均為0。試驗表明，該病毒本身不能凝集紅細胞，但是經過1%胰蛋白酶處理后，能夠使紅細胞發生凝集。

2.3.2干擾NDV試驗結果干擾NDV試驗結果見表3。接種分離病毒液及PBS的尿囊液HA均為陰性；同時接種分離病毒液及NDV LaSota病毒的雞胚尿囊液HA效價為21og2～41og2；單獨接種NDV LaSota病毒的雞胚尿囊液HA效價為91og2～101og2。說明分離到的病毒對NDV LaSota病毒有明顯的干擾作用。

表2　病毒血凝性測定結果

表3　干擾NDV試驗結果

2.3.3 RT-PCR鑒定電泳結果見圖3。從圖中可以看出，F6代尿囊液通過RT-PCR擴增后的產物大小約1700bp，與預期片段大小相符。使用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收目的片段，并送樣測序。測序結果表明，分離的IBV毒株的S1基因長度為1620bp，編碼540個氨基酸。

圖3　RT-PCR電泳結果

選取具有代表性的國內外毒株及疫苗株利用DNAMAN軟件進行核苷酸序列比對，發現HP-W株S1基因的核苷酸序列與國內使用較廣泛的歐洲呼吸型疫苗株H120、H52的同源性分別為78.7%和78.8%；與美國腎型、呼吸型代表毒株Ho1te、M41的同源性分別為78.8%和79%；與澳大利亞腎型株T的同源性為79.4%；與臺灣地區分離株JP8443、TW97-4的同源性分別為78.4%和77.4%；與國內腎型疫苗株W93和Ji1in的同源性為78.6%和79.1%；與腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I的同源性為78.7%；與變異株4/91的同源性為98.9%。HP-W株S1基因編碼的氨基酸序列同變異株4/91的同源性達98.1%，同其他毒株氨基酸序列的同源性均低于80%。利用軟件構建系統進化樹，結果顯示該分離株（HP-W株）與現有的呼吸型及腎型疫苗株的親緣關系均較遠，同變異株4/91有很近的親緣關系。

3　討論

我國自從1982年首次分離到IBV后，不斷有IBV變異毒株發生和流行的報道[7]。調查研究發現，2010～2012年間，IBV在常見疫病中的檢出率超過15%，混合感染率也呈現不斷增加的趨勢，說明中國雞傳支流行越來越嚴重[8]。導致這種結果的主要原因是IBV的變異產生了大量免疫逃逸毒株，或者因為持續使用各種各樣的疫苗，出現了大量二重、三重或多重的雜交、變異毒株。IBV變異毒株的抗原性發生改變，導致其血清型眾多，且新的血清型還在不斷出現，但彼此之間的交叉保護率較低或不產生交叉保護，這使得IB的防治越來越困難。本次從發病雞腎臟和肺組織中分離得到一株病毒“HP-W”，經血凝特性測定、干擾NDV試驗及RT-PCR，鑒定得出所分離到的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。

鑒于IBV的多型性和可變性，且在疾病的傳播過程中有變異株或新的基因型出現，需要對IBV的分子流行病學進行調查分析，掌握其分子流行病學規律，了解各個地區流行毒株的基因型，有針對性地選擇疫苗進行防控。本研究為疫苗株的篩選提供了試驗依據，為雞傳染性支氣管炎疾病的防控奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Saif Y M.禽病學[M].11版.北京：中國農業出版社，2005：108-130.

[2]朱英奇，李露，王世傳，等.雞傳染性支氣管炎病毒上海株的分離與鑒定[J].中國動物傳染病學報，2012，20 （4）：24-27.

[3]邵攀峰，李新華，李少麗，等.雞傳染性支氣管炎病毒HZ13株的分離與鑒定[J].中國家禽，2014，36（4）：43-45.

[4]李曉峰，鄭振宇，楊紅瑞，等.一株雞呼吸型傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定[J].河南科技學院學報，2012，40 （6）：39-43.

[5]陳雨昕.H9N2亞型禽流感病毒與雞傳染性支氣管炎病毒的協同致病作用[D].揚州：揚州大學，2014.

[6]葛紅江，李時健.雞傳染性支氣管炎與大腸桿菌混合感染的診治[J].畜禽醫藥，2014（12）：41-42.

[7]李盂，孫蓉，梁遠東，等.雞傳染性支氣管炎病毒抗原性的研究進展[J].廣西畜牧獸醫，2010，26（5）：317-322.

[8]尤永君，張國中，劉月煥，等.2010～2012年中國部分地區雞傳染性支氣管炎流行病學調查[J].畜牧獸醫學報，2015，46（2）：264-172.

Isolation and Identification of a Strain of Avian Infectious Bronchitis Virus

HAO Weiwei，XU Yanfang，FANG Pengfei，et a1.
（Sichuan Huapai Biopharmaceutica1 Co.Ltd.，Sichuan Jianyang 641401，China）

Abstract：Nephridia1 and 1ung tissue of sick chicken co11ected from pou1try yard，were inocu1ated on SPF embryonated chicken eggs for seria1 passages.Dwarf and dysp1asia embryos were observed from 3rd passage.The resu1ts of vira1 hemagg1utination test，interference of NDV test and RT-PCR identification demonstrated that the virus was identified as IBV，named HP-W.S1 gene of this strain was amp1ified and sequenced，we found its 1ength was 1620bp，and the sequence of nuc1eotides and aminoacids shared 98.9% and 98.1% identity with 4/91 strain，but 1ess than 80% with other strains.

Key words：Avian infectious bronchitis virus；Iso1ation；Identification

作者簡介：郝偉偉（1985—），女，山東濟寧人，碩士，四川省華派生物制藥有限公司研發人員，從事禽苗研發工作。

收稿日期：2015-10-30

中圖分類號：S858.315.3

文獻標識碼：B

文章編號：1001-8964（2016）02-0029-04