雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的研究*

張海峰

（黑龍江省林業科學研究所，哈爾濱　150081）

?

雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的研究*

張海峰

（黑龍江省林業科學研究所，哈爾濱150081）

摘要：以雜種落葉松興7×日77-2、日12×興9、日3×興9、日3×興2、日5×興9未成熟合子胚為外植體，初步建立雜種落葉松胚性愈傷組織誘導體系。結果表明：不同雜種落葉松在不同培養基和蔗糖濃度下的誘導情況不盡相同，基本培養基中MSG與MS培養基的誘導效果比較好，激素濃度的差異對雜種落葉松也有影響，2,4-D濃度為2.0 mg/L時，誘導率高，蔗糖濃度為30 g/L能誘導出胚性愈傷組織，高濃度的蔗糖反而抑制了胚性愈傷的形成。ABA分別為0、5、10、20、30 mg/L的5個處理中，除對照及ABA30 mg/L時沒有誘導出體細胞胚，其他試驗組均有一定數量的體細胞胚，但誘導率較低。幾種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導最適合的采樣時間是7月中旬。

關鍵詞：雜種落葉松；體細胞胚胎發生；愈傷組織；組織培養

*黑龍江省自然科學基金項目（C200801）資助

落葉松（Larix gmellini）為落葉喬木，其樹高達35 m，且材質堅硬、耐腐朽[1]，是我國北方一個優良的速生針葉樹種，也是主要鄉土樹種，其造林面積占東北人工林一半以上[2]。落葉松種間雜交具有明顯的雜種優勢，不同地區最適合的雜交組合不同，不同組合的雜種優勢也不同。目前，黑龍江省已選育出一批能適應一定環境、抗逆性強，且速生豐產的優良落葉松雜種家系[3-6]。但由于落葉松存在生長周期長、有性繁殖后代變異大、扦插生根率低等問題，致使其優良性狀難以維系。體細胞胚發生具有數量多、繁殖快、結構完整、植株再生率高、不受季節影響等特點，是植物大規模無性繁殖的一種主要手段。目前，國內外對落葉松及不同組合雜種落葉松已經建立了較穩定的體細胞胚發生體系[7-9]。為此，本研究利用體細胞胚胎發生技術，對雜種落葉松胚性愈傷組織進行誘導，以期為建立高效、穩定的雜種落葉松體細胞胚胎發生體系提供技術參考。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

2011年7月中旬、7月末、8月初，在牡丹江市林口縣青山林場雜種落葉松種子園采集雜種落葉松興7×日77-2、日12×興9、日3×興9、日3×興2、日5×興9的未成熟種子，取其合子胚作為外植體進行愈傷組織誘導試驗。限于篇幅，本文部分內容僅以具有代表性的日3×興9的研究結果進行統計分析。

1.2試驗方法

1.2.1外植體類型對愈傷組織的誘導

將日3×興9完整胚（帶胚乳）、胚軸、子葉3種外植體類型接種于胚性愈傷組織誘導培養基中，觀察不同外植體類型對胚性愈傷組織誘導的影響。

1.2.2不同培養基及蔗糖、BA、2,4-D濃度對5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

采用L9(34 )正交設計研究基本培養基種類及不同蔗糖、BA、2,4-D濃度對興7×日77-2、日12×興9、日3×興9、日3×興2、日5×興9胚性愈傷組織誘導的影響，共9個處理，每個處理重復3次。誘導方法是將接種后的培養基置于暗中培養，培養溫度為25℃，每隔30天轉移繼代1次。

1.2.3發育時期對5種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

取去掉胚乳的合子胚作為外植體，接種在MS+BA0.05 mg/L+2,4D2.0 mg/L+KT0.05 mg/L培養基上，采用單因素完全隨機試驗設計，研究了種胚發育時期對興7×日77-2、日12×興9、日3×興9、日3×興2、日5×興9胚性愈傷組織誘導的影響。本試驗共選擇了3個不同取材時期，每個取材時期重復3次。

表1　基本培養基種類、蔗糖、BA及2,4-D濃度組合

1.2.4胚性愈傷組織的增殖

以日3×興9外植體為研究對象，在誘導培養基上發生胚性愈傷組織后，將其轉入分別添加濃度為0、0.2、0.1 mg/L 2，4-D的培養基上進行培養，每個處理重復3次，繼代培養兩次后，對胚性愈傷組織的增長量進行記錄和統計分析。

1.2.5體細胞胚的形成

將誘導、增殖所得到的將要分化的胚性愈傷組織轉接到以MS培養基為基本培養基，并分別添加ABA 0、5、10、15、20、30 mg/L的培養基中，同時附加蔗糖30 g/L，其余條件不變。

1.2.6數據處理與統計分析

通過統計愈傷組織、體細胞胚的個數，計算出愈傷組織及體細胞胚產生的百分數。

體胚發生率=產生愈傷的幼胚數量/接種培養的所有幼胚數量×100%

胚性愈傷誘導率=產生愈傷的幼胚數量/接種培養的所有幼胚數量×100%

試驗獲得的愈傷組織使用解剖鏡記錄、拍照，培養30天后，統計胚性愈傷組織的誘導率，采用Excel 2007和SPSS19.0軟件處理數據，最后進行方差分析與多重比較。

2　結果與分析

2.1雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的研究

2.1.1外植體類型對日3×興9雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

在供試的3個外植體類型中，以完整胚（帶胚乳）、胚軸為外植體的供試材料誘導出了胚性愈傷組織（圖1，圖2），其中以完整胚（帶胚乳）為外植體時，誘導率最高（13.3%）。以分離的子葉和胚軸為外植體時，僅胚軸有胚性愈傷組織出現，但誘導率很低（6.6%）；而以子葉為外植體時，沒有愈傷組織發生（表2）。

圖1　胚軸處產生胚性愈傷

圖2　胚性愈傷團

表2　外植體類型對日3×興9雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

2.1.2培養環境對胚性愈傷組織誘導的影響

以日3×興9未成熟合子胚為外植體，在培養基上進行了不同光暗處理對雜種落葉松愈傷組織誘導影響的研究，8周后的調查結果（表3）表明，光照條件（C）培養下，外植體部分形成綠色致密的愈傷組織，有部分外植體褐化，在少數綠色致密愈傷組織中有不定芽出現。先黑暗培養30天后再移到光照下的處理（B），在黑暗情況下有胚性愈傷團形成（圖3），但轉移到光下后，胚性愈傷組織全部變成褐色、致密的愈傷組織（圖4），沒有進一步分化、增殖。經過2個月的暗培養（A），外植體產生胚性愈傷組織的誘導率達9.2%，且能進一步保持。這說明，各種植物愈傷組織對光照條件要求不同，雜種落葉松體胚的誘導條件和愈傷組織一樣都需要在黑暗條件下啟動，光照反而會抑制胚性愈傷組織的形成和進一步發育。

表3　培養環境對雜種落葉松愈傷組織誘導的影響

圖3　胚性愈傷圖

圖4　褐色愈傷組織

2.1.3不同培養基及蔗糖、BA、2,4-D濃度對5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

由表4可以看出，不同雜種落葉松在不同培養基和蔗糖濃度下的誘導效果不盡相同，其中MSG與MS培養基的誘導效果比較好；激素濃度的差異對雜種落葉松的誘導效果也有影響，2,4-D濃度為2.0 mg/L時誘導率高；蔗糖濃度為30 g/L時，能誘導出胚性愈傷組織，高濃度的蔗糖反而抑制了胚性愈傷的形成。在日本落葉松與興安落葉松雜交品種中，選擇MSG或MS培養基，同時附加BA0.5 mg/L+2,4-D2.0 mg/L效果較好，可作為進一步研究的基礎。

表4　不同培養基和蔗糖、BA、2,4-D濃度對5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

2.1.4發育時期對5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響

試驗結果（表5）表明，不同發育時期對5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導的影響不同，胚性愈傷組織誘導最適宜的采樣時間是7月中旬，但此時僅能保持發生率在10%左右，且誘導率較低。而7月末和8月初接種的僅有少量胚性愈傷組織出現，絕大部分出現大量褐色、紅色的非胚性致密的愈傷組織。這說明在誘導胚性愈傷組織時，外植體材料以幼嫩為宜，因為此時其內含物質正處于最旺盛的時期。

2.2胚性愈傷組織的增殖與體細胞胚的形成

2.2.1激素濃度對胚性愈傷組織增殖的影響

試驗結果（圖5）表明，隨著激素濃度的下降，增殖數量增加，但增殖率非常低，而且褐化情況也有所降低。經方差分析，差異不明顯（P＞0.05）。

表5　不同發育時期幼胚的愈傷組織發生率　%

圖5　激素濃度對胚性愈傷組織增殖量和褐化率的影響

2.2.2體細胞胚的形成

胚性愈傷組織增殖培養1、2次后，接入體細胞胚誘導培養基中，試驗結果（圖6）表明，除對照及ABA30 mg/L時，僅有一些畸形胚出現，以及部分提前萌發外，其他試驗組均有一定數量的體細胞胚，誘導率較低。這說明落葉松誘導體細胞胚發生時需要一定濃度的ABA催化。

圖6　 ABA濃度對體細胞胚發生的影響

3　結　論

5種雜種落葉松胚性愈傷組織誘導最適合的采樣時間是7月中旬。在日本落葉松與興安落葉松雜交品種中，選擇MSG或MS培養基，同時附加BA0.5 mg/L+2,4-D2.0 mg/L時，誘導率高，可作為進一步研究的基礎。蔗糖濃度為30 mg/L時，能誘導出胚性愈傷組織，高濃度的蔗糖反而抑制了胚性愈傷的形成。

參考文獻

［1］周以良.黑龍江樹木志［M］.哈爾濱:黑龍江科學技術出版社，1986.

［2］潘立本,張含國,周顯昌.雜種落葉松的增產能力及其生產應用前景［J］.林業科技開發,1998（2）:18-20.

［3］張含國,張成林,蘭士波,等.落葉松雜種優勢分析及家系選擇［J］.南京林業大學學報(自然科學版),2005,29（3）:69-72.

［4］李艷霞,李若林,周顯昌,等.雜種落葉松優良家系及優良單株的選擇［J］.林業科技,2009,34（1）:5-7.

［5］翁海龍，王福德，王鑫，等.雜種落葉松繼代嫁接幼化技術研究初報［J］.林業科技，2015,40（1）:22-23.

［6］楊柏林，賈慶彬，張含國，等.雜種落葉松優良家系選擇研究［J］.林業科技，2014,39（2）:1-4.

［7］齊力旺,韓一凡,李玲.華北落葉松體細胞胚發生及植株再生實驗系統的建立［J］.實驗生物學報,2000,33（4）:357 -365.

［8］呂守芳,張守攻,齊力旺,等.日本落葉松體細胞胚胎發生的研究［J］.林業科學,2015,41（2）:48-53.

［9］于祎，趙彤彤，楊巍，等.紅松成熟合子胚愈傷組織誘導的適宜培育條件［J］.森林工程，2015,31（2）:5-7.

（責任編輯：王岳）

Study on the Induction of Embryogenic Callus of Hybrid Larchs

ZHANGHaifeng
（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150081）

Abstract By the immature zygotic embryos of Larix gmelinii 7×L.kaempferi 77-2,L.kaempferi 12× L.gmelinii 9,L.kaempferi 3×L.gmelinii 9,L.kaempferi 3×L.gmelinii 2,L.kaempferi 5×L.gmelinii 9 as explants,hybrid Larch embryogenic callus induction system was preliminarily established.The results showed that different hybrid larch in different culture medium and sucrose concentration are not the same,basic culture medium MSG and MS for inducing effect better,differences in hormone concentrations for Larch had also been affected,the concentration of 2,4-D at 2.0 induction rate high,sucrose concentration at 30 induce embryogenic callus,high concentration sucrose inhibited the embryonic callus formation.ABA were 0,5,10,20,30 mg/L 5 treatment,except the control and ABA 30mg/L did not induce somatic embryos,there was a certain number of somatic embryos and induction frequency is low in other groups.The most suitable sampling time of several hybrid larch embryogenic callus induction was in the middle of July.

Key words Hybridlarchs;Somatic embryogenesis;Callus;Tissue culture

收稿日期：2016-01-05

作者簡介：第1張海峰（1975-），男，高級工程師，碩士學位，主要從事經濟林、林木遺傳育種方向研究。

文章編號：1001-9499（2016）02-0009-04

中圖分類號：S791.22,S722.3+7

文獻標識碼：A