一株米根霉固態發酵代謝產物的分析

楊雨琨，唐　潔（.湖北省大冶市第一中學，湖北大冶43500；.勁牌有限公司，湖北大冶43500）

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一株米根霉固態發酵代謝產物的分析

楊雨琨1，唐潔2
（1.湖北省大冶市第一中學，湖北大冶435100；2.勁牌有限公司，湖北大冶435100）

摘要：分析1株來源于小曲白酒中米根霉G12固態發酵的代謝產物。通過在實驗室模擬小曲白酒固態發酵工藝建立小試發酵平臺，添加純種米根霉作為酒曲，經糖化、發酵、蒸餾，測定餾液中主要揮發性成分，對照組為不添加任何酒曲。結果表明，米根霉G12具有較強的產酒能力，產酒平均出酒率為12.10 %。同時該株菌在固態發酵中也能產生大量正丙醇與雜醇油，因而對雜醇油的生成有一定的貢獻。研究可為降低小曲白酒雜醇油途徑提供不同的思路。

關鍵詞：米根霉；固態發酵；產物分析；白酒

清香型小曲白酒的工藝特點是先糖化，后發酵，清蒸流酒，續米查配料。小曲酒釀造工藝流程為：原料→泡糧→蒸糧(裝甑、初蒸、悶水、復蒸)→培菌(出甑攤晾、翻糧、加曲、進箱保溫)→發酵(配糟、出箱、攤晾、混合、入池)→蒸餾[1]。獨特的釀造工藝，造就了小曲清香型白酒具有以乙酸乙酯為主體的協調復合香氣，清香純正、入口微甜、香味悠長、落口干爽、微有苦味等特點。乙酸乙酯、乳酸乙酯、高級醇是構成清香型小曲酒的主體香味成分，且組分中具有酯低、酸高、高級醇高等特征[2]。但與大曲清香白酒相比，小曲清香型白酒特點是口味簡單、出酒率高，酒的品質和口感不如大曲酒豐富。

清香型小曲白酒發酵過程中酵母主要起產酒精和代謝風味物質作用，雜醇油是其代謝副產物。米根霉在釀酒過程中產生糖化酶及液化酶，可將原料中的淀粉轉化成酵母可以利用的糖類物質，主要起糖化作用[3]。另外，有文獻報道米根霉還有一定的產酒精的作用，在發酵過程中，還可產生一些風味物質，但沒有具體的數據表明。開展本試驗的目的就是考察米根霉的產酒能力，以及其對小曲白酒固態發酵中主要微量成分如乙酸乙酯、雜醇油的生成是否有貢獻。

1　材料與方法

1.1材料

實驗菌株：分離于小曲白酒酒曲，經純化、麩皮管保藏的菌種米根霉G12，作為實驗菌種；高粱為東北高粱。

主要試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉為生化級試劑，氯化鈉為分析試劑。

主要儀器：高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、超凈工作臺、Agilent 7890A型氣相色譜儀（配有氫火焰檢測器和7863型自動進樣器，美國安捷倫公司產品）。

YPD瓊脂培養基：酵母提取物1 %，葡萄糖2 %，蛋白胨2 %，瓊脂粉2 %，121℃滅菌20 min。

1.2實驗方法

本研究模擬釀造車間生產工藝流程進行，即蒸糧、糖化培菌、入瓶發酵和蒸餾。為避免發酵過程中其他微生物生長影響實驗結果，蒸糧后攤晾及后續操作均在無菌室中進行。試驗分成兩組進行，設置實驗組和空白組：實驗組加入純種根霉曲，空白組不添加任何酒曲。

1.2.1蒸糧

蒸糧的目的在于使淀粉顆粒吸水、膨脹、破裂、糊化，以利于淀粉酶的作用和后續糖化及發酵過程在微生物的利用；同時，在高溫下，糧食也得以滅菌，并排除一些揮發性的不良成分。

在三角瓶中稱取250 g東北高粱，自來水浸泡24 h后，瀝干水分，經過初蒸（121℃，20 min）、悶糧（100℃，25 min）和復蒸（115℃，10 min），使糧食水分在53 %～60 %，感官上達到大部分開口，軟硬適中。復蒸時，紗布包扎瓶口，避免雜菌進入。

1.2.2糖化培菌

糖化過程包括淀粉經酶作用生產糖和酒曲中微生物利用糖增殖兩個過程。為確保糖化過程中產香正常，小試試驗中熟糧糖化培菌在恒溫培養箱中進行，控制培養溫度為30℃。

熟糧在無菌室內攤晾后，按1 %的加曲量，分別稱取2.5 g純種根霉曲加入實驗組，混合均勻，在培養箱中30℃糖化24 h。空白組為不添加酒曲的熟糧直接放入培養箱。

1.2.3入瓶發酵

糖化醅與配糟按一定比例混勻后入容器，在酵母、霉菌、細菌等微生物作用下產生乙醇、酸、酯及其他各種成分的過程即為發酵。

配糟采用大試車間復原糟，干糟與水按3∶7比例混合，浸泡3 h，121℃滅菌20 min。滅完菌后，復原糟水分控制在70 %～72 %。糖化醅與配糟按1∶1的重量比例混合入瓶，塞上裝有2.5 mol硫酸的發酵栓，在培養箱中30℃發酵7 d。

1.2.4蒸餾

發酵結束后，取1000 g發酵酒醅，利用小型蒸餾器蒸餾，接取溜出液50 mL。

1.2.5酵母計數

為防止發酵過程中污染酵母影響米根霉代謝產物的分析，對發酵結束后酒醅樣品進行酵母計數。取發酵結束后的酒醅，稱10 g樣品于100 mL無菌生理鹽水中，150 r/min振蕩30 min，在無菌操作臺上吸取200 μL菌懸液，均勻涂布在YPD平板上，30℃培養2～3 d后計數。平板計數以30～300個菌落數為有效數值。

1.2.6氣相色譜檢測

溜出液利用氣相色譜儀檢測微量成分組成及含量，具體方法見文獻[4]。

2　結果與分析

2.1酵母計數

培養3 d后，各酒醅樣品中酵母計數結果見表1。實驗組和空白組在發酵過程中均有樣品出現酵母感染的現象，尤以實驗組1和空白組8感染酵母較多，不可計數。這很可能與糖化時放在恒溫培養箱中開放式培菌有關，也與發酵器皿未洗干凈、酒精消毒未徹底有關。但實驗組2—6，空白組7未受酵母污染，具有實驗意義。

表1 發酵結束時酒醅中酵母在YPD平板上數量

2.2色譜數據分析

2.2.1米根霉G12產酒精能力分析

將發酵結束蒸餾得出的餾液進行酒精度檢測，折算成55 %vol出酒率情況見表2。實驗組1酒精度和出酒率都比其他組高，這與該實驗組污染大量酵母有關。實驗組2—6酒精度和出酒率相差不大，平均出酒率為12.01 %。空白組理論酒精度和出酒率應該為0 %，由于空白組8感染酵母原因，導致酒精度和出酒率比理論值高。由此可以判斷，米根霉G12不僅具有糖化功能，還有一定的產酒精能力，與文獻報道相吻合。

表2 各酒醅樣品酒精度及折55 %vol出酒率情況

2.2.2米根霉G12產酯、產雜醇油能力分析

清香型小曲白酒主體香味成分為乙酸乙酯，由表3可知，米根霉G12代謝產乙酸乙酯能力非常弱，平均為5.84 mg/100 mL，說明該菌株對小曲白酒酯香無貢獻作用；該菌株代謝生成正丙醇平均值為39.19 mg/100 mL、雜醇油平均值為97.99 mg/100 mL，空白值為0，說明該菌株具有較強的產正丙醇和雜醇油能力。傳統觀點認為，正丙醇和雜醇油均是酵母代謝產酒精的副產物，其中降低雜醇油含量方法之一就是選育低產雜醇油的酵母菌株。本試驗發現米根霉也具有產雜醇油的能力，說明其對小曲白酒中雜醇油的生成有一定的貢獻作用。

表3 各酒醅樣品代謝產酯及雜醇油情況

3　結論

研究了純種根霉曲以高粱為原料在實驗室進行小試固態發酵，對發酵結束后蒸餾得出的餾液進行分析，得出米根霉G12具有較強的產酒能力，產酒平均出酒率為12.10 %。同時根霉G12在固態發酵中也能產生大量正丙醇與雜醇油，因而對小曲白酒中雜醇油的生成有一定的促進作用。說明雜醇油的生成菌株不一定全是酵母，可以拓寬思路為降低小曲白酒中雜醇油途徑提供不同的方法。

參考文獻：

[1]李銳利.高產乙酸乙酯酵母的選育及在清香型小曲酒中的應用研究[D].武漢：湖北工業大學, 2011.

[2]楊強,王衍,童國強.清香型小曲酒的香味組分特點及風味特征[J].釀酒科技, 2001(2)：75-76.

[3]馮春，汪光明，楊強,等.綠衣觀音土曲中微生物種群區系分析及其功能研究[J].釀酒科技,2005,129(3)：39-42.

[4]王海瑞，陳軍.氣相色譜內標法測定白酒中高級醇與酯類[J].農產品加工（學刊）,2014,361(8)：54-56.

Analysis of the Metabolites of a Rhizopus oryzae Strain in Solid-State Fermentation

YANG Yukun1and TANG Jie2
（1.No.1 Middle School of Daye, Daye, Hubei, 435100；2.Jingpai Co. Ltd., Daye, Hubei 435100, China）

Abstract：To analyze the metabolites of the Rhizopus oryzae strain G12(isolated from Xiaoqu Baijiu) in solid-state fermentation, we simulated the solid-state fermentation techniques of Xiaoqu Baijiu and built a small-scale testing platform in the laboratory. With purebred Rhizopus oryzae as starter, we measured the main volatile components of the distillate after saccharification, fermentation and distillation, while the control group was without starter. The results showed that, Rhizopus oryzae G12 had strong alcohol-producing ability, with the average liquor yield of 12.10 %. Meanwhile, the strain produced a large amount of n-propanol and fusel oils in solid-state fermentation, which contributed to the generation of fusel oils. The study provided a different idea for the reducing of the content of fusel oils in Xiaoqu Baijiu. (Trans. by HUANG Xiaoli)

Key words：Rhizopus oryzae; solid-state fermentation; metabolites analysis; Baijiu

作者簡介：楊雨琨，學生。

收稿日期：2016-03-01

DOI：10.13746/j.njkj.2016063

中圖分類號：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0122-03

優先數字出版時間：2016-03-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160314.1133.001.html。