玉米單倍體再生植株的SSR分析

摘要：使用４７個ＳＳＲ標記，對１０株玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）單倍體再生植株進行了遺傳分析，結果表明，單倍體植株的帶型均來源于其親本，未發現無性系變異。分別篩選出２９對在鄭５８與Ｂ７３間有多態性、１６對在西５０２與昌７２間有多態性的引物，對單倍體植株與其親本間的遺傳相似性系數進行分析，發現來源于鄭５８／Ｂ７３的６株單倍體植株與鄭５８的遺傳相似性系數（５１．０６％～６１．７０％）均小于其與Ｂ７３的遺傳相似性系數（７６．６０％～８７．２３％），發生了偏向于Ｂ７３的遺傳分離；具有西５０２／昌７２遺傳背景的４株單倍體植株未見偏分離現象。

關鍵詞：玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）；單倍體；ＳＳＲ；遺傳分離

中圖分類號：Ｓ５１２．１；Ｑ７８９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4965-03

ＳＳＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ｒｅｇｅｎerａｔｅｄ Ｈａｐｌｏｉｄ Ｐｌａｎｔｓ

ＨＵＡＮＧ Ｍｉｎ，ＤＵ Ｈｅ－ｗｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕbｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： １０ ｈａｐｌｏｉｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ４７ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｎｏ ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔｓ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｂａｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｆｒｏｍ ｔｈｅｉｒ ｐａｒｅｎｔｓ’． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ４７ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ， ２９ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ Ｚｈｅｎｇ５８ ａｎｄ Ｂ７３； ｗｈｉｌｅ １６ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｉ５０２ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ７２． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｔｈｅ ６ ｈａｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｍｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｚｈｅｎｇ５８／Ｂ７３ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ ｔｏｗａｒｄ Ｂ７３ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｚｈｅｎｇ５８（５１．０６％～６１．７０％） ｗｅｒｅ ａｌｌ ｓｍａｌｌｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｗｉｔｈ Ｂ７３（７６．６０％～８７．２３％）； Wｈｉｌｅ ｎｏ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ４ ｈａｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｏｆ Ｘｉ５０２／Ｃｈａｎｇ７２．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）； ｈａｐｌｏｉｄ； ＳＳＲ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ

自交系的快速選育對提高玉米育種效率、縮短育種周期十分重要［1］。傳統的二環系選育方法需要７個世代才能得到純度為９９．２％的自交系，選育周期長，耗時、費力。而使用單倍體加倍技術只需２個世代便可得到純度為１００％的雙單倍體（ｄｏｕｂｌｅｄ－ｈａｐｌｏｉｄ，ＤＨ）系，極大地縮短了育種周期，降低了成本，提高了效率，單倍體技術已經逐漸被廣泛應用于玉米的遺傳育種。玉米ＤＨ系獲得的常用方法有兩種：一是花藥、小孢子組織培養技術；二是孤雌生殖單倍體技術。玉米花藥和小孢子培養技術比較成熟，但是其培養周期長，過程復雜，受基因型、季節性影響大，且只局限于少數幾個材料，嚴重阻礙了該技術在育種上的應用［2－4］。以Ｓｔｏｃｋ６為材料，選育出了許多單倍體誘導率高的誘導系［5－7］，然而，單倍體加倍率低一直制約著該技術在玉米育種上的應用。杜何為等［8］以玉米單倍體胚芽鞘節為外植體，建立了新的玉米單倍體組織培養體系。本研究對從該體系再生的單倍體植株進行了無性系變異分析，以期為該技術在玉米單倍體育種上的應用提供理論指導。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 材料與試劑 玉米Ｆ１雜交組合西５０２／昌７２、鄭５８／Ｂ７３由杜何為等組配［8］，玉米單倍體誘導系是來源于Ｓｔｏｃｋ６的母本單倍體誘導系。ＰＣＲ反應的Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ和Ｔａｑ酶均購自Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司，其他試劑均為分析純。

１．１．２ ＳＳＲ引物 參照王鳳格等［9］，選用４７對ＳＳＲ引物用于無性系變異分析，引物名稱及其在基因組上的定位見文獻［8］。

１．２ 方法

１．２．１ 單倍體再生植株的獲得 采用杜何為等［7］獲得的單倍體再生植株。具體方法為：使用單倍體誘導系作為父本，分別與西５０２／昌７２、鄭５８／Ｂ７３雌穗授粉。收獲后選取紫頂白胚的單倍體子粒，經質量分數為２％的次氯酸鈉溶液處理２０ ｍｉｎ、無菌水洗滌４～５次，接種于ＭＳ培養基中獲得無菌苗。待單倍體幼苗長至５～６ ｃｍ，切?。?ｃｍ的胚芽鞘節（胚芽鞘節上、下各０．５ ｃｍ），并用手術刀等分，用作外植體。經愈傷組織誘導、繼代及單倍體植株分化再生培養，獲得１０株單倍體植株，其中６株來源于鄭５８／Ｂ７３，４株來源于西５０２／昌７２。

１．２．２ 單倍體葉片ＤＮＡ提取 采用ＣＴＡＢ法提取和純化單倍體葉片基因組ＤＮＡ［10］，并檢測ＤＮＡ的濃度和質量，將ＤＮＡ樣品稀釋至１０ ｎｇ／μＬ，４ ℃保存備用。

１．２．3 玉米花粉Ｉ－ＫＩ染色 再生植株抽雄后，有部分雄穗能散粉。取散粉的花藥，放在載玻片上，滴一滴質量分數０．２％的Ｉ－ＫＩ溶液，壓片。放在顯微鏡下觀察并拍照。

１．２．4 ＳＳＲ分析 選用４７對ＳＳＲ引物，對再生單倍體植株進行無性系變異分析。ＰＣＲ反應體系為２５ μＬ，包括１０×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，各１ μＬ的雙向引物（０．１ μｍｏｌ／Ｌ），模板ＤＮＡ（１０ ｎｇ／μＬ）５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １３．３ μＬ，最后滴一滴液體石蠟油［11］。ＰＣＲ擴增程序為：９５ ℃ ３ ｍｉｎ；９５ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃ １０ ｍｉｎ；４ ℃保存。ＰＣＲ擴增產物用４％低熔點瓊脂糖凝膠，１３０ Ｖ電泳２ ｈ，然后于凝膠成像系統觀察、拍照。

２ 結果與分析

２．１ 再生植株的育性分析

對１０株單倍體再生植株的育性進行了分析，再生植株的雄穗未見散粉（圖１－ｂ），Ｉ－ＫＩ染色發現，１０株單倍體再生植株的花粉粒不被染色（圖１－ｃ），表現為不育。

２．２ 再生植株的無性系變異分析

使用４７對ＳＳＲ引物對單倍體再生植株的遺傳變異進行分析（圖２、圖３），２９對引物在鄭５８與Ｂ７３間有多態性，１６對引物在西５０２與昌７２間有多態性。１０株單倍體植株的多態性帶型均與親本相同，說明未產生無性系變異。

來源于鄭５８／Ｂ７３的６個單倍體植株與鄭５８的遺傳相似性系數（５１．０６％～６１．７０％）均小于其與Ｂ７３的遺傳相似性系數（７６．６０％～８７．２３％），說明６株單倍體植株發生了偏向Ｂ７３的遺傳分離（表１）。來源于西５０２／昌７２的單倍體植株，經ＳＳＲ標記和遺傳相似性分析，未見偏分離現象。

３ 小結與討論

使用４７對ＳＳＲ引物，對１０株單倍體再生植株進行了分析，未見無性系變異，說明建立的單倍體胚芽鞘節組織培養體系獲得的單倍體植株遺傳穩定性好，這也可能是由于使用的ＳＳＲ標記較少，未能檢測到變異位點所致。

偏分離現象在分子標記定位的分離群體中比較普遍，造成該現象的原因有遺傳的因素，也有非遺傳的因素［１2，１3］。本研究中來自鄭５８／Ｂ７３遺傳背景的單倍體植株中出現了偏分離現象，可能是由于Ｂ７３具有優良的組織培養特性［１4－１8］，在組織培養過程中，含有Ｂ７３基因型的單倍體莖節易于誘導出愈傷組織，且分化率較高，故發生偏向Ｂ７３的分離。

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