過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織中白介素9及轉錄因子PU.1表達水平的研究

顧兆偉，趙 鶴，曹志偉

110004遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科

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·論著·

過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織中白介素9及轉錄因子PU.1表達水平的研究

顧兆偉，趙 鶴，曹志偉

110004遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科

【摘要】目的探討輔助性T細胞9(Th9細胞)相關細胞因子白介素(IL)-9 mRNA/蛋白及轉錄因子PU.1 mRNA在過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織中的表達及其作用。方法2014年7月選取SPF級Balb/c小鼠16只，采用隨機數字表法分為兩組，每組8只。實驗組小鼠使用雞卵清蛋白致敏，建立過敏性鼻炎小鼠模型；對照組小鼠同期使用0.9%氯化鈉溶液。每組采用隨機數字表法取4只小鼠，病理檢查證明造模成功。每組剩余4只小鼠取鼻黏膜，采用實時熒光定量PCR法檢測小鼠鼻黏膜組織中IL-9、轉錄因子PU.1 mRNA表達水平，采用流式微球術檢測小鼠鼻黏膜組織中IL-9表達水平。結果實驗組小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平〔(21.88±1.82)與(1.03±0.11)〕、轉錄因子PU.1 mRNA表達水平〔(24.63±1.88)與(1.02±0.07)〕高于對照組(P<0.05)。實驗組小鼠鼻黏膜組織中IL-9表達水平〔(66.9±4.4)pg/ml與(20.9±2.1)pg/ml〕高于對照組(P<0.05)。小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平與轉錄因子PU.1 mRNA表達水平呈正相關(r=0.952，P<0.001)。結論Th9細胞相關細胞因子IL-9和轉錄因子PU.1參與過敏性鼻炎的發生發展過程，該結果將有希望提高對過敏性鼻炎發病機制的了解，為過敏性鼻炎免疫調節治療潛在靶點的選擇提供新的線索。

【關鍵詞】鼻炎；T淋巴細胞,輔助誘導；白介素9；轉錄因子

顧兆偉，趙鶴，曹志偉.過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織中白介素9及轉錄因子PU.1表達水平的研究[J].中國全科醫學，2016，19(12)：1420-1423，1428.[www.chinagp.net]

Gu ZW，Zhao H，Cao ZW.Expression levels of IL-9 and PU.1 in nasal mucosa of allergic rhinitis mice[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1420-1423，1428.

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見的上呼吸道慢性炎癥性疾病，表現為連續打噴嚏、清水樣涕、鼻塞及鼻癢等不適。雖然沒有生命危險，但對患者的生活質量和工作效率造成嚴重影響。AR一直被認為是一種過敏反應，主要涉及輔助性T細胞2(Th2細胞)，并且伴隨輔助性T細胞1(Th1細胞)的相對缺乏[1]。雖然Th2細胞介導的免疫反應機制可以解釋AR的很多特點，但是這種簡單的炎癥模型并不足以充分解釋其免疫機制，研究發現，Th1細胞炎性反應并未使Th2細胞應答占主導的過敏反應炎癥減輕[2]，這表明過敏性疾病的發病機制不能完全歸咎于Th1細胞/Th2細胞失調，而很可能同時伴有其他機制，并在發病過程中發揮重要作用。近年來，發現了一個新的獨立的Th細胞亞群——輔助性T細胞9(Th9細胞)，其高水平表達白介素(IL)-9[3-4]。IL-9可以影響炎性細胞以及正常組織細胞，增加淋巴細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞的數量，刺激IgE的分泌，增強肥大細胞對過敏原的免疫應答，促進黏蛋白的表達，并刺激分泌炎性細胞因子[5-8]。轉錄因子PU.1是Th9細胞特異性轉錄因子，與Th9細胞的分化和生物功能的發揮密切相關[9]。最近的研究證實，Th9細胞/IL-9及其轉錄因子PU.1參與了支氣管哮喘的發生和發展[10],但尚不清楚AR中Th9細胞相關細胞因子IL-9和轉錄因子PU.1的表達情況。目前研究認為，AR和支氣管哮喘是同一氣道的同一疾病[11]。因此，本研究擬使用小鼠建立AR模型，通過檢測小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA/蛋白、轉錄因子PU.1 mRNA表達水平及其相互關系，探討Th9細胞在AR發生、發展中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料2014年7月選取SPF級Balb/c小鼠16只，雄性，6～8周齡，體質量18～20 g(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)；無菌飼料(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)；雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA)(美國，Sigma-Aldrich，A5253)；氫氧化鋁粉(分析純，購自天津市大茂化學試劑廠)。

1.2模型建立小鼠在屏障系統中飼養，采用隨機數字表法分為兩組，每組8只。實驗組小鼠使用雞卵清蛋白致敏，將100 μg雞卵清蛋白+2 mg氫氧化鋁粉溶于0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液中，分別于造模的第0、2、4、6、8、10、12、14天對實驗組小鼠進行腹腔注射，第15～25天每日分別用500 μg雞卵清蛋白溶于10 μl 0.9%氯化鈉溶液中，對小鼠進行滴鼻，每個鼻孔10 μl，連續激發11 d。對照組小鼠均同期使用等量0.9%氯化鈉溶液進行相同處理。

1.3模型評價通過激發，小鼠會出現鼻癢、打噴嚏、清水樣涕等癥狀，末次激發后觀察30 min。計分標準：鼻癢：輕摩擦鼻幾次為1分，抓撓鼻面部不止為2分，到處摩擦為3分；打噴嚏:1～3個為1分，4～10個為2分，11個及以上為3分；清水樣涕:流到前鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。以疊加法記錄總分，總分超過5分即為造模成功。應用上述計分標準記分，實驗組小鼠均大于5分，對照組小鼠均小于5分。

1.4病理檢查兩組小鼠均于末次激發后2 h處死，每組采用隨機數字表法取4只小鼠，頭部放入乙醇甲醛混合固定液固定，之后置入5%甲酸溶液中脫鈣4周，然后包埋成蠟塊。蠟塊制作完成后，進行切片，厚度2 μm。使用蘇木素-伊紅(HE)染色，后進行光鏡檢查。光鏡下可見實驗組小鼠鼻黏膜腫脹及嗜酸粒細胞浸潤，對照組小鼠鼻黏膜未見明顯腫脹及嗜酸粒細胞浸潤(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)，說明造模成功。

1.5取材每組剩余4只小鼠處死后取其鼻黏膜，并且將鼻黏膜分成2份，其中一份制備成單細胞懸液，離心(300×g，10 min)，取上清液，用于細胞因子檢測，另一份直接用于提取RNA。

1.6反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)應用TRIzol試劑盒(Invitrogen，上海)提取小鼠鼻黏膜組織細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度及純度。使用PrimeScript RT-PCR kit(Takara,大連)將0.5 μg總RNA反轉錄成cDNA。使用ABI 7500進行RT-PCR檢測。以β-actin作為內參，IL-9和轉錄因子PU.1作為目的基因。β-actin上游引物：5′-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3′,下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′，擴增產物長度137 bp；IL-9上游引物：5′-GGGCATCAGAGACACCAAT-3′,下游引物：5′-GGACGGAGAGACACAAGCA-3′，擴增產物長度104 bp；轉錄因子PU.1上游引物：5′-CTTCCAGTTCTCGTCCAAGC-3′,下游引物：5′-TTCTTCACCTCGCCTGTCTT-3′，擴增產物長度135 bp。使用2ΔΔCT法測出目的基因mRNA表達水平。

1.7流式細胞儀流式微球術(cytometric bead assay，CBA)采用CBA檢測上清液IL-9 表達水平，按照試劑盒說明書嚴格操作。使用BD FACSCanto Ⅱ flow cytometer(BD Biosciences)獲得數據，FACSDiva and BD CBA software 4.2(BD Biosciences)用于結果分析。IL-9 表達水平檢測極限為10.7 pg/ml。

注：A為正常組，未見明顯嗜酸粒細胞浸潤；B為實驗組，可見嗜酸粒細胞浸潤

圖1兩組小鼠鼻黏膜蘇木素-伊紅染色結果(×200)

Figure1ResultsofHEstainingofnasalmucosainthemiceofthetwogroups

2結果

2.1小鼠鼻黏膜組織中IL-9、轉錄因子PU.1 mRNA表達水平比較實驗組小鼠鼻黏膜組織中IL-9、轉錄因子PU.1 mRNA表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of the expression levels of IL-9 and PU.1 mRNA in nasal mucosa of mice between control group and experimental group

組別只數IL-9mRNA轉錄因子PU.1mRNA對照組41.03±0.111.02±0.07實驗組421.88±1.8224.63±1.88t值22.87025.099P值<0.001<0.001

注：IL-9=白介素9

2.2小鼠鼻黏膜組織中IL-9表達水平比較實驗組小鼠鼻黏膜組織中IL-9表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平與轉錄因子PU.1 mRNA表達水平相關性小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平與轉錄因子PU.1 mRNA表達水平呈正相關(r=0.952，P<0.001,見圖2)。

Table2ComparisonoftheexpressionlevelofIL-9innasalmucosaofmicebetweencontrolgroupandexperimentalgroup

組別只數IL-9對照組420.9±2.1實驗組466.9±4.4t值18.870P值<0.001

注：IL-9=白介素9

圖2小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平與轉錄因子PU.1 mRNA表達水平相關性散點圖

Figure 2Scatter diagram of the correlation between the expression levels of IL-9 and PU.1mRNA in nasal mucosa of mice

3討論

AR是以嗜酸粒細胞及肥大細胞浸潤為特點的Ⅰ型變態反應[11]。Th細胞及其分泌的細胞因子在調節嗜酸粒細胞和肥大細胞的遷移、凋亡和功能中發揮著核心作用[12]。AR一直被認為是一種過敏反應，主要涉及Th2細胞，并且伴隨Th1細胞的相對缺乏[1]。Th1細胞分泌干擾素γ(IFN-γ)介導細胞免疫，而Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13來調解體液免疫[12]。IL-5刺激骨髓中嗜酸粒細胞發育，進入血液循環，而IL-4和IL-13可上調趨化因子(如eotaxin)，促進嗜酸粒細胞浸潤[13]。

Th9細胞是最近發現的以分泌細胞因子IL-9為典型特征的CD4+效應性T細胞，由輔助性T細胞0(Th0細胞)在IL-4和轉化生長因子β(TGF-β)的特殊刺激下共同誘導產生或由TGF-β作用于Th2細胞分化而來[3-4]。不同于已知的Th1細胞、Th2細胞、輔助性T細胞17(Th17細胞)、Treg細胞，Th9細胞的特異性轉錄因子是PU.1，從而在基因水平上也提示Th9細胞與其他輔助性T細胞亞群不同[14]。研究顯示，Th9細胞在支氣管哮喘等免疫應答過程中起重要作用，Th9細胞功能的發揮主要依靠其分泌的功能性細胞因子IL-9實現[10]。

IL-9最初被認為是在小鼠體內刺激T細胞和肥大細胞的生長因子[15]，對IL-9 的了解近年來在動物模型以及人體實驗中逐漸擴展，有研究在支氣管哮喘患者支氣管活檢組織中發現IL-9 mRNA表達水平升高，過度表達IL-9的轉基因小鼠模型也在抗原刺激的作用下表現出高氣道反應性、嗜酸粒細胞浸潤以及IgE大量生成等支氣管哮喘模型的表現[16]。而IL-9基因敲除的小鼠模型或者應用IL-9中和抗體的實驗則可以得到逆轉氣道高反應性，減少嗜酸粒細胞浸潤等[17-18]。上述實驗證實了IL-9在支氣管哮喘發病過程中對抗原反應的支持以及其在免疫調節中起到的重要作用。趙鶴等[11]利用免疫組化SABC法在AR小鼠鼻黏膜組織中檢測到IL-9表達水平升高。

本實驗采用RT-PCR以及CBA法檢測AR小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA/蛋白的表達情況，結果發現，實驗組小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA/蛋白均呈高表達，明顯高于對照組。提示IL-9在AR發生發展中起到重要作用。Th9細胞是IL-9的主要來源，但是由于Th9 細胞在AR小鼠鼻黏膜中大量表達導致IL-9 表達水平升高還是基因調控導致IL-9 表達水平升高仍存在爭議。

轉錄因子PU.1在產生Th9細胞表型中起著至關重要的作用，是Th9細胞轉錄因子[9]。在人T細胞中IL-9的產生需要轉錄因子PU.1與IL-9基因相結合。研究發現，通過小鼠T細胞條件缺失或人T細胞小干擾RNA(siRNA)導致轉錄因子PU.1表達水平下降，均會導致IL-9表達水平下降，然而轉錄因子PU.1的高表達會增加IL-9的表達[19-20]。本研究結果顯示，實驗組小鼠鼻黏膜組織中轉錄因子PU.1 mRNA表達水平升高，小鼠鼻黏膜組織中IL-9 mRNA表達水平與轉錄因子PU.1 mRNA表達水平呈正相關，間接提示了Th9細胞的高表達。下一步有必要對AR小鼠鼻黏膜組織中Th9細胞表達進行檢測，明確Th9細胞的表達在調節AR中的作用。

眾所周知，嗜酸粒細胞及肥大細胞浸潤同樣是AR的特征表現[12]。IL-9可以影響炎性細胞以及正常組織細胞，增加淋巴細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞的數量。在一定的條件下，IL-9對Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、調節性T細胞和Th9細胞的表達亞群起到多效性影響，根據微環境的不同扮演不同的角色[21-23]。考慮到對Th細胞在AR中的重要性以及IL-9對Th細胞的影響，本課題組下一步將阻斷IL-9的表達來明確其對Th細胞亞群分化以及AR的影響。

綜上所述，本研究發現Th9細胞相關細胞因子IL-9和轉錄因子PU.1參與AR的發生發展過程，該結果將有助于提高對AR發病機制的了解，為AR免疫調節治療潛在靶點的選擇提供新的線索。

作者貢獻：顧兆偉進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；趙鶴進行實驗實施、評估、資料收集；曹志偉進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Expression Levels of IL-9 and PU.1 in Nasal Mucosa of Allergic Rhinitis Mice

GUZhao-wei，ZHAOHe，CAOZhi-wei.DepartmentofOtorhinolaryngology，ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and role of T helper cells 9(Th9)-related cytokine IL-9 mRNA/protein and transcription factor PU.1 mRNA in the nasal mucosa of allergic rhinitis(AR) mice.MethodsIn July 2014,16 Balb/c mice were selected and randomly divided into two groups with 8 mice in each group.In experimental group,mice were used for establishing the animal models of AR with ovalbumin sensitization,and at the same time,control group were administrated with 0.9% physiological saline.In each group,4 mice were randomly taken and the pathological examination showed that the model building was successful.The nasal mucosa was taken from the remaining 4 mice in each group,and IL-9 and PU.1 mRNA were detected by real-time quantitative PCR and IL-9 protein in nasal mucosa of the two groups was detected by flow cytometry.ResultsThe expression levels of IL-9 mRNA 〔(21.88±1.82)vs.(1.03±0.11)〕,PU.1 mRNA 〔(24.63±1.88)vs.(1.02±0.07)〕in the nasal mucosa of the experimental group were higher than those in the control group(P<0.05).The expression level of IL-9 protein in the nasal mucosa of the experimental group 〔(66.9±4.4)pg/ml vs.(20.9±2.1)pg/ml〕 was higher than that in the control group(P<0.05).The expression level of IL-9 mRNA was positively correlated with the expression of PU.1 mRNA in the nasal mucosa of mice(r=0.952,P<0.001).ConclusionTh9-related cytokine IL-9 and transcription factor PU.1 are involved in the development of AR.Our results may improve the understanding of the pathogenesis of AR and provide a new clue for the selection of potential target of immune regulation therapy for AR.

【Key words】Rhinitis；T-lymphocytes,helper-inducer；Interleukin-9；Transcription factors

(收稿日期：2015-09-22；修回日期：2016-01-15)

【中圖分類號】R 765.21

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.013

通信作者：曹志偉，110004遼寧省沈陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻咽喉科；E-mail：caozw2008@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30872849)；國家自然科學基金青年基金項目(81200730)；遼寧省自然科學基金資助項目(2014021047)