氟樂靈降解菌株的分離鑒定及降解特性研究

季麗+吳偉

摘要： 分離篩選出1株能高效降解養殖水體中氟樂靈的微生物菌株FJ-01，經生理生化和序列同源性分析，將該菌株鑒定為Leucobacter菌。結合水產養殖的實際情況，該菌降解氟樂靈的最適pH值為6.0～8.5，最適溫度為22～30 ℃，最佳光照條件為光暗比12 h∶ 12 h，最佳接種量為0.01%，氟樂靈的初始濃度0.05 mg/L。

關鍵詞： 氟樂靈；生物降解；16S rDNA；Leucobacter菌；降解特性

中圖分類號：X172 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0390-04

氟樂靈（trifluralin），別稱氟樂寧、氟特力、茄科寧等，化學名稱為2，6-二硝基-N，N-二丙基-4-三氟甲基苯胺，分子式C13H16F3N3O4。實際生產中氟樂靈的常用劑為48%的乳油制品，是一種廣泛應用的二硝基苯胺類選擇性芽前除草劑。因其在蝦蟹育苗及養殖過程中可治療和預防真菌病（鏈壺菌病）[1]且具滅苔不傷草的功效，也廣泛應用于水產養殖中。

然而有研究表明，氟樂靈可使受試動物發生癌變、染色體突變并對哺乳動物具有基因毒性[2-4]。氟樂靈對哺乳動物、蝦、蟹、鳥類的毒性較低，但對魚類的毒性很大[5]。針對氟樂靈的使用情況和有關毒理學試驗數據，2004年11月底，美國環保署再次修訂氟樂靈最高殘留限量[6]，重新修訂后為 0.05 mg/kg。2010年日本多次檢出我國出口的鰻魚、梭子蟹等水產品中氟樂靈超標，對我國漁業經濟造成一定影響。

利用微生物來降解農藥最早報道于1951年，當時 Audus[7]研究了土壤微生物對2，4-D的降解，引發了世人對微生物降解能力的關注。微生物降解技術相對于物理、化學技術，具有高效、徹底、無二次污染和成本低等優勢，已成為近年來研究的熱點。

目前對于氟樂靈的研究主要著重于其對動植物的影響，在土壤中的遷移、轉化、降解[8-10]以及檢測方法[11-13]。對于如何去除水環境和生物體內的氟樂靈報道較少，因此篩選更多類型水體中的氟樂靈高效降解菌對于氟樂靈殘留的生物修復研究和應用具有十分重要的意義。本研究從受污染池塘底泥中篩選到1株可降解低氟樂靈濃度的菌株，并研究其降解特性，以期為合理使用漁用藥物和保證水產品質量安全提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 氟樂靈降解菌分離源

氟樂靈降解菌分離自江蘇宜興多年使用過氟樂靈的蝦蟹養殖池塘的底泥。采用柱狀采泥器采集5個不同的池塘底泥各500 g，裝入無菌的玻璃廣口瓶中，4 ℃保存下運回實驗室備用。

1.2 培養基與試劑

菌株富集所用的培養基（葡萄糖1 g、蛋白胨10 g、硝酸銨0.2 g、酵母膏0.06 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鈉1 g、水1 L），pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

菌株馴化培養所采用的無碳源培養基（硝酸銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鈉1 g、水1 L），pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

菌株保存培養基采用液體或固體的肉湯培養基[牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g（固體需加瓊脂20 g）、蒸餾水1 L]，pH值為7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3 氟樂靈降解菌株的篩選、分離和純化

無菌條件下取養殖池塘的底泥1 g，置于經滅菌冷卻的99 mL富集培養基中，30 ℃、150 r/min振蕩48 h培養。將經富集培養后的底泥懸濁液靜置0.5 h，在無菌條件下取1 mL上清液于99 mL富集培養基中按上述條件繼續培養48 h。取10 mL經培養所得的菌液于250 mL無碳源培養基（含 0.01 mg/L 氟樂靈）中，培養（條件均為30 ℃、150 r/min）48 h后將菌液轉接至下一批次新的無碳源培養基中，并逐步加大無碳源培養基中氟樂靈的濃度，從0.01 mg/L提高至 2.0 mg/L。每次轉接前需測定培養液中氟樂靈的實際含量，濃度有明顯下降則表明培養液中有降解菌株的存在。

將混合培養物經含2.0 mg/L氟樂靈的無碳源培養基平板涂布，并將其進行分離化，取最終的馴化培養液1 mL于 9 mL 無菌水中，得到10-1的稀釋度，并依次獲得10-2和10-3的稀釋度。從3個不同的稀釋度中取樣，在含2.0 mg/L氟樂靈的無碳源培養基平板上進行涂布分離，每個稀釋度做3個平行，放入30 ℃的恒溫培養箱中培養3 d。選擇菌落疏密適當的平板，在顯微鏡下觀察，挑取生長狀況良好、形態不同的菌落于液體肉湯培養基中培養，再將分離所得的各菌株在平板上連續轉接、傳代5次，選擇其中能在含氟樂靈無碳源培養基上生長的菌株，轉接至試管斜面，于4 ℃冰箱保存。

將純化得到的菌株用肉湯培養基培養至菌數為 109 CFU/mL 水平，按5%的比例接種于250 mL裝有100 mL 0.5 mg/L氟樂靈無碳源培養基的三角瓶中，放置振蕩培養箱中30 ℃、150 r/min振蕩培養5 d。每隔24 h取樣1次，經適當稀釋后測定D600 nm，做3個平行，分別以培養時間、D600 nm吸光值為橫、縱坐標繪制菌株的生長曲線。同時測定其中氟樂靈的濃度，選擇降解率和生長性能均較好的菌株作為最終的目標菌株，進行鑒定和降解特性的研究。

1.4 氟樂靈降解率的分析測定

菌株分離篩選時，氟樂靈的測定采用氣相色譜（GC）法，其中色譜條件的選擇參照文獻[14]。取培養液50 mL于 250 mL 分液漏斗中，加入色譜純二氯甲烷10 mL，搖振萃取 5 min，靜置分層，取有機溶劑層，經4 000 r/min離心10 min，棄殘余水相。有機相在氮氣下吹干，再用二氯甲烷定容至 1 mL，經0.22 μm的濾膜過濾后進氣相色譜分析。

氟樂靈的降解率=（Ct-C0）/C0×100%。

式中：Ct為培養液中氟樂靈的最終濃度， mg/L；C0 為培養液中氟樂靈的初始濃度， mg/L。

1.5 氟樂靈降解菌株的16S rDNA的分析

為進一步確定所選菌株的種屬，在進行菌落形態觀察的同時采用16S rDNA方法鑒定菌株。按SK8255（細菌）試劑盒的操作程度提取菌株的DNA，使用細菌通用引物7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540 r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）擴增其片段，對擴增產物進行電泳觀察（1%瓊脂糖電泳，150 V 100 mA，20 min），并由生工（上海）生物工程有限公司進行測序，所得基因序列經Blast程序與GenBank核酸數據庫進行比對分析，采用MEGA 5.1軟件進行同源性比對分析并建立系統發育樹[15]。

1.6 氟樂靈降解菌株的生長曲線及降解特性

在2 500 mL三角瓶中加入1 000 mL的養殖水體水樣（水質COD為17.75 mg/L，TN為1.6 mg/L，TP為0.30 mg/L，NH+4-N為0.70 mg/L，NO-3-N為0.15 mg/L，NO-2-N為0.10 mg/L，pH值為7.0），經滅菌冷卻后根據養殖生產的實際情況和條件加入氟樂靈并接入一定量的培養至對數生長期的菌液（菌液濃度1×109 CFU/mL），研究在不同的溫度（15、22、30 ℃）、pH值（6.0、7.0、8.5）、光暗比（4 h ∶ 20 h、12 h ∶ 12 h、20 h ∶ 4 h）、接種量（1%、0.1%、0.01%）和氟樂靈濃度（0.01、0.05、0.5、1.0、2.0 mg/L）下，菌株經5 d連續作用后對氟樂靈的降解能力；試驗設3組平行。

2 結果與討論

2.1 氟樂靈降解菌株的分離、篩選和純化

以江蘇宜興多次使用過氟樂靈的5個蝦蟹養殖池塘底泥（S1～S5）為分離源，采用富集培養基培養后獲得混合菌源。將混合菌源接入含0.01～2.0 mg/L氟樂靈的無碳培養基中，經30 ℃、150 r/min振蕩培養48 h，分析培養前后培養液中氟樂靈的降解情況，以判別降解菌的存在和選擇適宜的分離源。試驗結果詳見圖1。

由圖1可知，在30 ℃、150 r/min條件下培養48 h，因揮發等因素的影響，對照組CK的氟樂靈（0.01～2.0 mg/L）有5.31%～25.08%的去除率，且隨著濃度的上升而增大。相對于對照組，富集于S1、S2池塘底泥的菌源，其對氟樂靈的降解效果不顯著（P>0.05），而富集于S3～S5池塘底泥的菌源則具有良好的降解效率。其中S4的菌源對于0.05 mg/L以上的氟樂靈降解效果尤其顯著（P<0.05），扣除對照組本底變化值后分別達到11.31%、12.48%、12.56%、17.54%和 13.12%。因此降解氟樂靈的菌株重點在S3～S5池塘底泥的菌源中篩選。

將S3～S5這3組的菌株培養物在無菌條件下，經含氟樂靈2.0 mg/L的無碳源培養基平板進行涂布和分離純化，共獲得菌株7株，編號為FJ-01～FJ-07。將這7株菌株對 0.5 mg/L 的氟樂靈進行5 d的降解，降解結果見圖2。由圖2可知，在所篩選出的7株菌株中，5 d內對0.5 mg/L氟樂靈降解效果較好的有4株菌，分別為FJ-01、FJ-02、FJ-06和FJ-07，降解率大于76%（扣除對照組本底后大于55%），其中FJ-01菌株的降解率最高，達84.1%（扣除對照組本底后為64.6%）。

試驗同時測定了4株具有較好降解作用菌株的生長曲線。由圖3可知，4株菌在含0.5 mg/L氟樂靈的無碳培養基中生長良好。相比較而言，FJ-01菌株的生長比較活躍，是唯一D值超過1.0的菌株，因此將其作為降解的首選菌株進行研究和探索。

2.2 氟樂靈降解菌株FJ-01的菌落形態觀察和16S rDNA分析

所篩得的氟樂靈降解菌FJ-01在固體肉湯培養基中培養24 h后，菌落圓形且呈乳白色或淡黃色，四周邊緣較為光滑，表面濕潤，不易挑取，革蘭氏染色呈陽性（圖4）。

以FJ-01菌株的基因組DNA為模板，利用引物7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540 r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）對FJ-01菌16S rDNA片段進行PCR擴增，結果見圖5。其中右側第1個條帶為FJ-01菌16S rDNA的擴增片段，左側為對比條帶marker。從該圖的凝膠成像圖可以看出，PCR反應得到的擴增產物長度為1 500 bp，符合16S rDNA的片段大小。

FJ-01的16S rDNA序列在NCBI上比對分析后發現其與多株Leucobacter菌的16S rDNA相似，調出其中相似度較高的Leucobacter菌 16S rDNA序列，建立系統發育樹。經計算，菌株FJ-01與Leucobacteralbus strain IAM 14851距離最近，兩者同源性為91%，可以判斷FJ-01菌株與Leucobacteralbus strain IAM 14 851為不同種，但同屬于Leucobacter屬。具體種仍待進一步分析，其系統發育樹見圖6。

2.3 氟樂靈降解菌株FJ-01的降解特性研究

根據養殖生產中氟樂靈使用的實際情況和條件，研究了不同的溫度、pH值、光暗比、接種量和氟樂靈初始濃度對菌株FJ-01降解能力的影響，了解菌株FJ-01的降解特性。

2.3.1 氟樂靈初始濃度對菌株FJ-01降解能力的影響 為考察氟樂靈初始濃度對菌株FJ-01降解的影響，試驗根據養殖生產中的實際情況，選擇了0.01、0.05、0.5、1.0、20 mg/L 5個濃度。試驗條件為：溫度30 ℃、水體pH值為7.0、光暗比為12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，試驗時間為 5 d。試驗結果見圖7。

由圖7可以看出，當其他條件一致時，經過5 d的試驗，5個濃度組的氟樂靈均有不同程度的降解：其中0.01 mg/L濃度組的降解率偏低，僅為17.46%，而其他各濃度組的氟樂靈降解較明顯，降解率均大于38%，其中0.05 mg/L組的降解效果最為顯著，達66.26%。5個濃度組中0.05、0.5、1.0 mg/L這3個濃度組的降解率較為接近。降解率的不同與濃度有直接的關系，0.01 mg/L組本身濃度偏低，可利用性差；而 2.0 mg/L 組濃度偏大，對菌株的生長代謝有一定的抑制作用，故降解率又會有一定的下降。0.05～1.0 mg/L 組的濃度處于菌株代謝的適宜范圍，而生產實際中氟樂靈的常用濃度是005 mg/L，因此該菌對養殖水體環境中殘留氟樂靈的降解是有效和適宜的。

2.3.2 溫度對菌株FJ-01降解能力的影響 為考察水體溫度對菌株FJ-01降解的影響，試驗根據養殖生產中的實際情況，選擇了水溫為15、22、30 ℃ 3個溫度。試驗條件為：水體pH值7.0、光暗比12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗時間為5 d，試驗結果見圖8。

由圖8可以看出，相對于15 ℃時22.58%的降解率而言，22 ℃ 和30 ℃ 時FJ-01菌株對氟樂靈5 d的降解率分別達到51.62%和67.32%，表明溫度較高適宜氟樂靈的降解。一方面，水溫較高，特別是30 ℃左右時，正是微生物生長代謝的適宜溫度，有利于微生物對氟樂靈的代謝轉化；另一方面，水溫上升有利于氟樂靈的揮發，從而加快其去除。15 ℃的水溫較低，降解率也偏低，但此時一般不進行養殖生產或雖然養殖但不需要使用氟樂靈，因此對實際應用的影響不大。養殖生產中使用氟樂靈主要在早春水溫22 ℃左右，用于殺滅水中的水綿，其次是在水溫30 ℃左右時防治蝦病。而這2個溫度條件下FJ-01菌株對氟樂靈有50%以上的降解率，故適宜在實際生產中應用。

2.3.3 pH值對菌株FJ-01降解能力的影響 為考察水體pH值對菌株FJ-01降解的影響，試驗根據養殖生產中實際情況，選擇了水體pH值為6.0、7.0、8.5的3個值。試驗條件為：水溫30 ℃、光暗比12 h ∶ 12 h、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗時間為5 d，試驗結果見圖9。

從圖9可以看出，pH值為6.0、7.0、8.5時，菌株FJ-01降解氟樂靈無顯著差異，5 d后降解率分別為61.97%、66.26% 和68.05%，表明在pH值在6.0～8.5范圍內，對菌株的降解能力無影響，且養殖水體的pH值基本在此范圍內波動，故對菌株FJ-01而言是適宜降解的條件。

2.3.4 光暗比對菌株FJ-01降解能力的影響 為考察光暗比對菌株FJ-01降解的影響，試驗根據養殖生產中的實際情況，選擇了光暗比為20 h ∶ 4 h、12 h ∶ 12 h、4 h ∶ 20 h（光照度為2 500 lx）3個水平。試驗條件為：水溫30 ℃、pH值為 7.0、菌體接種量為0.1%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗時間為5 d，試驗結果見圖10。

由圖10可以看出，在5 d的試驗中，各組最終的降解率在63.93%～66.15%之間，并無顯著性差異，但5 d中的降解速率存在差異。光暗比為20 h ∶ 4 h、12 h ∶ 12 h的2組，在試驗前2 d的降解速度明顯快于光暗比為4 h ∶ 20 h的試驗組，且2 d的降解率分別為55.04%和51.79%，遠大于光暗比為4 h ∶ 20 h試驗組的39.32%。表明在試驗開始后的2 d內，菌株處于適應并增殖狀態，氟樂靈的降解中包含了部分的光降解，若此時光照時間長，降解率會明顯提高。隨著微生物代謝能力的加劇，后3 d此種影響減弱，氟樂靈的代謝以菌株的代謝為主，最終的降解率趨于一致。

2.3.5 接種量對菌株FJ-01降解能力的影響 為考察菌株FJ-01接種量對降解效果的影響，試驗根據養殖生產中的實際情況，選擇了接種量為1%、0.1%和0.01% 3個水平進行試驗。試驗條件為：水溫30 ℃、pH值為7.0、光暗比 12 h ∶ 12 h，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L，試驗時間為5 d，試驗結果見圖11。

由圖11可以看出，在5 d的試驗中，各組最終的降解率在60.19%～62.41%之間，并無顯著性差異，但5 d中的降解效果存在差異。接種量為0.1%和1%的2組，試驗前2 d的降解效率明顯要高，2 d的降解率分別為54.44%和 53.15%，遠大于另一組的35.93%。表明在試驗開始后的 2 d 內，菌株處于適應和增殖狀態，菌株活性菌數高的試驗組降解能力明顯要強，但隨著菌體的代謝，從第3天起降解作用效果趨于一致。因此菌株的接種量以0.1%為佳，但在實際生產中應用必須考慮經濟有效性以及最終的降解結果，故接種量的選擇宜小不宜大，0.01%及以下的接種量則更加適宜，這還有待于在實際應用中加以修正和完善。

3 小結

采用富集培養基和含氟樂靈的無碳源培養基從養殖池塘底泥中定向分離得到具有降解功能的4株菌株，菌株分別標記為FJ-01、FJ-02、FJ-06和FJ-07。將此4菌株加入含有氟樂靈的無碳源培養基中，經過5 d的培養，發現FJ-01菌株在培養液中生長情況最好，且對氟樂靈的降解率最高，故選擇FJ-01菌株作為重點研究菌株。

對菌株FJ-01進行了純化和培養，分析了其菌落、菌株形態，提取了菌體DNA并進行了16S rDNA片段的PCR擴增，對擴增得到的目標片段進行測序。利用Blast對序列結果進行比對，構建系統發育樹進行分析，初步確定菌株FJ-01為Leucobacter sp.。

研究表明，結合水產養殖的實際情況，菌株FJ-01對氟樂靈降解的適宜條件為：pH值為6.0～8.5，水溫為22～30 ℃，光暗比為12 h ∶12 h，接種量為0.01%，氟樂靈初始濃度為0.05 mg/L。

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