玉米莖腐病生防菌的篩選鑒定及最佳培養條件研究

李宛澤+郭月霞+王忠武

摘要： 以禾谷鐮刀菌為指示菌測定生物活性，分離自土壤的7個細菌菌株對玉米莖腐病禾谷鐮刀菌具有較強的抑菌活性，其抑菌率在46.9%～81.3%。采用生防菌菌懸液，于發病初期對莖基部噴霧，生防菌G3田間防效達78.3%，后對生防效果最好的G3菌株進行培養條件優化。結果表明，最優培養條件為：培養基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適合溫度為25 ℃。

關鍵詞： 玉米莖腐病；篩選；生防菌；培養條件

中圖分類號： S435.131.4+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0148-02

玉米莖腐病又稱玉米莖基腐病、玉米青枯病等，是世界玉米產區普遍發生的一種土傳病害。嚴重者玉米葉片全部黃枯，根壞死，果穗下垂，莖基髓部中空，極易折倒。發病率一般在10%～20%，嚴重時可達75%。通過化學藥劑防治可以控制種傳或土傳病菌引起的苗期病害，但是對人體健康和生態環境造成很大的危害。隨著人們健康和環保意識的增強，探索和研制高效的、對人體和生態環境無害的生防制劑引起國內外學者的普遍重視。應用生物防治手段防治玉米病害的研究日益受到重視。本試驗對該病的生物防治技術進行了初步研究，通過對病株根際土壤樣品的篩選獲得有效控制玉米莖腐病的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗玉米品種為感病品種黃早4，試驗對照化學藥劑為20%福·克可濕性粉劑。

1.2 供試病原菌

玉米莖腐病禾谷類鐮刀菌，由吉林農業科技學院病理實驗室提供。

1.3 生防細菌的分離

采自吉林市郊區以往莖腐病發病農田的根際土樣52份，用NA培養基稀釋分離，共分離菌株107株，將分離到的菌株編號保存。

1.4 生防菌抑菌效果測定

將PDA培養基培養好的的供選生防菌，挑1環用無菌水稀釋至108倍，取2 mL和25 mL的NA培養基混勻，倒入無菌培養皿中制成帶毒培養基平板，培養基凝固后，在每個平板中接入1個供試菌菌餅（直徑為7 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養基表面，以水與 PDA培養基混合的平板為對照，每個處理 3 次重復，25 ℃下培養4～7 d后，用十字交叉法測定供試菌生長直徑，計算抑制率直徑。

1.5 生防菌株田間防效小區試驗

成株期傷莖根埋法接種，結合自然發病方法，對篩選到的7株生防菌菌株進行田間防效試驗。每小區5行，每行17株玉米，9個處理（包括7株生防菌，對照藥劑，清水對照），每個處理4次重復。各生防菌用無菌水配制成108 CFU/mL的菌懸液，于發病初期對莖基部噴霧，每個小區5 L菌懸液。對照化學藥劑使用劑量按照商品說明書劑量使用。

1.6 調查方法

8月中旬和9月初對各小區進行調查，每小區逐株調查，計算防治效果：

防治效果=[（對照田發病株數-防治田發病株數）/對照田發病株數]×100%。

1.7 發酵及培養條件的優化

1.7.1 不同碳、氮源對生防菌液抑菌活性的影響 分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉代替葡萄糖；再分別以硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、尿素代替谷氨酸。按照“1.4”節 的方法測定，重復3次，確定最佳碳源和氮源。

1.7.2 不同培養條件對生防菌液抑菌活性的影響 在其他培養條件一致的條件下，用0.1% NaOH溶液和0.1%HCl溶液配制pH值為4、5、6、7、8、9的培養皿，共6個處理，3次重復，后按照“1.4”節的方法測定，確定最佳培養pH值。在其他培養條件一致的條件下，將培養皿分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫生化培養箱，共7個處理，3次重復，按照“1.4”節 的方法測定，確定最佳培養溫度。在其他培養條件一致的條件下，將生防菌分別置于全光照、全黑暗、光暗交替條件下于恒溫生化培養箱中，共3個處理，3次重復，后按照“1.4”節 的方法測定，確定最佳光照培養條件。

2 結果與分析

2.1 基本菌種判別

7株生防菌，革蘭氏染色均為陽性，細胞呈直桿狀，芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2.2 7株菌株對玉米莖腐病的抑菌力比較

從土壤中分離到107株細菌菌株，抑菌圈培養有7株生防菌對玉米莖腐病表現出抑制活性，這7株菌株對玉米莖腐病的抑菌率見表1，菌絲直徑均在15 mm以上，其中G3抑制活性最高，抑菌直徑平均為26.00 mm，抑制率達到81.3%，G21，G45次之，菌絲直徑為24.00 mm和23.00 mm抑制率達75.0%和71.8%，其余4株生防菌株，菌絲直徑在15.00～19.00 mm。

2.3 生防菌防治玉米莖腐病田間藥效試驗

從表2可以看出，7株生防菌對玉米莖腐病均有防治效果，防效達到21.1%～78.3%。生防菌G3防效最高，達到78.3%，與對照藥劑的防治效果81.11%差異不顯著，其次是G21、G45，雖與對照藥劑差異顯著但防治效果也分別為70.6% 和62.0%，G27、G17、G44、G23防治效果較差，防治效果在47.1%～21.1%。

2.4 對生防菌G3發酵及培養條件的優化

2.4.1 不同碳、氮源對生防菌G3抑菌活性的影響 以5 種不同碳源的培養基培養得到的生防菌G3對玉米莖腐病均有一定的抑菌活性，其中乳糖培養的抑菌效果最好，抑菌率為83.1%，麥芽糖及淀粉培養的抑菌活性較差（表3），因此，選用乳糖作為碳源。以5 種氮源的培養基培養得到的生防菌G3對玉米莖腐病均有一定的抑菌活性，其中氯化銨培養的抑菌效果最好，抑菌率為 85.1%，其次是硝酸鈉和谷氨酸，最差為尿素，抑菌率為47.1%（表3），因此，選用氯化銨作為碳源。

2.4.2 培養條件的優化 對培養條件進行了優化，試驗結果表明，培養基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適溫度為25 ℃，其抑菌活性最好。

3 結論與討論

近幾年生物農藥發展迅速，土壤中存在著豐富的細菌資源，目前，生物農藥僅占現有農藥體系的很少一部分，還有很大的發展空間。本次試驗共從莖腐病發病土壤中分離得到107株生防菌株，通過抑菌試驗、田間藥效試驗篩選到7 株對玉米莖腐病有較好防治效果的細菌菌株。其中G3田間藥效最高，可達到78.3%。在研究中還進行了對G3培養條件的優化，結果表明，最優培養條件為：培養基pH值為8，光照條件為光暗交替，最適溫度為25 ℃。這些試驗結果為下一步生防制劑的研究提供了基礎。

參考文獻：

[1]姜 云，黃麗麗，陳長卿，等. 一株拮抗番茄葉霉病菌的放線菌篩選、鑒定及發酵條件研究[J]. 微生物學報，2007，47（4）：622-627.

[2]趙淑莉，任飛娥，劉金亮，等. 玉米大斑病生防放線菌的篩選鑒定及發酵條件優化[J]. 微生物學報，2012，52（10）：1228-1236.

[3]范瑛閣，朱麗霞，龔明福. 生防菌H1和H2對黃瓜霜霉病的防效測定[J]. 北方園藝，2012（17）：149-150.

[4]趙 帥，田長彥，史應武，等. 黃瓜枯萎病生防菌HD-087產抗菌物質條件的優化及抑菌作用初探[J]. 微生物學通報，2013，40（5）：802-811.

[5]劉曉妹，劉文波，范秀利. 芒果細菌性黑斑病生防菌的篩選及防效測定[J]. 中國生物防治，2006，22（增刊1）：94-97.

[6]童蘊慧，郭桂萍，徐敬友，等. 拮抗細菌對番茄植株抗灰霉病的誘導[J]. 中國生物防治，2004，20（3）：187-189.