桑粉虱快速分子檢測技術(shù)

柴建萍+倪婧+江秀均+羅雁婕+謝道燕+白興榮

摘要： 桑粉虱[Pealius mori （Takahashi）]是我國植桑區(qū)重要的桑樹害蟲，在云南植桑區(qū)引起危害。針對桑粉虱蟲體小，與其他種類粉虱形態(tài)相似導(dǎo)致識別困難的問題，基于線粒體COⅠ分子標(biāo)記進行桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的工作，比較與桑粉虱親緣關(guān)系較近的6種粉虱COⅠ基因序列，設(shè)計桑粉虱種特異性引物sfs5-1/sfs5-2，擴增300 bp片段，建立桑粉虱快速分子檢測技術(shù)。該引物只對桑粉虱COⅠ基因具有擴增能力，而對煙粉虱、溫室白粉虱無擴增效果，且對桑粉虱單頭成蟲、卵粒、幼蟲具有較好擴增能力，表現(xiàn)出桑粉虱種的特異性。該引物靈敏性高，對桑粉虱DNA模板最低檢測值為0.15 ng/μL。該檢測技術(shù)簡便、高效，可用于桑粉虱鑒定、苗木調(diào)運過程害蟲檢測、種群遷移擴散監(jiān)測及防控機制研究等多個領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞： 桑粉虱；COⅠ基因；特異性引物；分子檢測

中圖分類號：S433.39 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0145-03

桑粉虱[Pealius mori（Takahashi）]屬同翅目粉虱科害蟲，是對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在較大威脅的6種重要粉虱類害蟲之一[1]。桑粉虱以幼蟲、成蟲刺吸桑葉汁液發(fā)生危害，其分泌物導(dǎo)致桑園煤污病流行，造成桑葉品質(zhì)及產(chǎn)量下降。近年來，國內(nèi)植桑區(qū)域呈現(xiàn)“東桑西移”格局，桑粉虱在云南植桑區(qū)暴發(fā)危害并呈擴大趨勢。由于各地對桑粉虱種類識別不清楚，缺乏靶標(biāo)害蟲發(fā)生規(guī)律、危害習(xí)性、藥劑防效等背景知識，導(dǎo)致防治效果低下、防控難度增大。

粉虱類害蟲的形體微小，種內(nèi)變異普遍，僅憑粉虱成蟲的外觀識別易造成種類鑒定混亂[2]。粉虱分類鑒定依據(jù)蛹殼特征而非成蟲特征[3]，蛹殼形狀和顏色，背面特征，邊緣的齒和剛毛，背剛毛和刺毛，胸部和腹部氣管褶、孔、冠、裂等特征是粉虱分類的重要依據(jù)[4]。桑粉虱蛹體長0.70～0.80 mm，呈黃褐色，橢圓形；成蟲體長0.70～0.80 mm，體淡黃色，被有白粉[5]，外形與其他種類粉虱極為相似。非專業(yè)研究人員很難直觀地將桑粉虱與其他種類粉虱區(qū)別開。應(yīng)用DNA序列的分子標(biāo)記技術(shù)可找出不同生物類群間的遺傳差異，彌補傳統(tǒng)形態(tài)分類方法的不足，能較快進行物種鑒定[6]。其中線粒體COⅠ基因被廣泛應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育及近緣種鑒定，在煙粉虱隱種鑒定、遺傳分化研究中發(fā)揮重要作用。但在昆蟲種類鑒定時，線粒體COⅠ基因需經(jīng)PCR擴增、檢測、測序、比對等諸多環(huán)節(jié)，操作過程耗時、費用高，特別在進行大量樣本鑒定時較為繁瑣。

本研究基于線粒體COⅠ分子標(biāo)記對桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定的結(jié)果，即桑樹上只有桑粉虱1種粉虱類害蟲危害，而桑園周邊蔬菜及經(jīng)濟作物以煙粉虱B型、溫室白粉虱發(fā)生危害[7]。比較桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱、螺旋粉虱、番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱等7種粉虱COⅠ基因序列，根據(jù)桑粉虱COⅠ基因的種間特異性設(shè)計引物，通過PCR擴增、電泳檢測，建立桑粉虱快速分子檢測技術(shù)，以期為植桑區(qū)桑粉虱害蟲識別、危害監(jiān)測及種群發(fā)生機制研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲源

桑粉虱采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所桑園（2014年6月），蟲態(tài)為成蟲、卵、幼蟲。煙粉虱樣本采自桑園周邊寄主植物薄荷（2012年5月），蟲態(tài)為成蟲。溫室粉虱采自大棚內(nèi)寄主植物黃瓜（2012年5月），蟲態(tài)為成蟲。煙粉虱及溫室粉虱經(jīng)過線粒體mt COⅠ分子標(biāo)記鑒定為煙粉虱B型及溫室白粉虱[7]。

1.2 試驗儀器與試劑

XW-80A渦旋儀（上海精科實業(yè)有限公司）；Sorva ll Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機（ThermoFish）；S1000 PCR擴增儀（BIO-RAD）；PowerPac Universal電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）；GelDoc TM+XR紫外凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD）。

DNA提取液：含50 mmol/L Tris-HCl （pH 值8.0）、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% SDS；Tris-EDTA緩沖液：含10 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）、1 mmol/L EDTA（pH 值8.0）；蛋白酶K（Merck）、Easy Taq DNA Polymerase、2.5 mmol/L dNTPs，購自Trans（北京）公司；引物由Invitrogen（上海）公司合成；其他無機試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 供試粉虱DNA提取

粉虱DNA提取方法參照柴建萍等方法[7]，分別提取5頭桑粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱基因組DNA。收集桑粉虱5個粒卵及5頭2齡幼蟲，進行桑粉虱卵、幼蟲基因提取。

1.4 桑粉虱特異性引物設(shè)計

根據(jù)柴建萍等報道的桑粉虱（登錄號：KP168713）測序結(jié)果[7]，以及NCBI數(shù)據(jù)庫中公開的煙粉虱（Bemisia tabaci）（登錄號：KF059959）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）（登錄號：HM185763）、螺旋粉虱（Aleurodicus dispersus）（登錄號：KC822648）、番荔枝褶粉虱（Aleurotrachelus anonae） （登錄號：HM150624）、番石榴黑棒粉虱（Aleuroclava guyavae）（登錄號：JQ340179）、伯粉虱待定種（Metabemisia sp.）（登錄號：JQ340198）7種粉虱COⅠ堿基序列，應(yīng)用CLUSTAL X 2.1、MEGA5軟件進行序列對比分析；用Primer Premer 5.0軟件設(shè)計桑粉虱特異性引物并進行評價。

1.5 引物特異性驗證

分別以鑒定為桑粉虱、煙粉虱B型、溫室白粉虱的各5頭成蟲的DNA為模板，用設(shè)計引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增驗證引物特異性。PCR擴增體系為25 μL，其中含 2.5 μL 10×buffer，1.9 μL 2.5 μmol/L dNTPs，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，0.2 μL 5 U/L Taq DNA聚合酶，1.8 μL 100 μg/mL DNA模板，加ddH2O補足。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μ L 擴增產(chǎn)物，加1 μL載樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠中，在100 V電壓下電泳15 min后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結(jié)果。

1.6 引物靈敏性檢測

以桑粉虱5頭幼蟲、5粒卵提取的基因組DNA為模版，用引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增檢測有效性；檢測桑粉虱DNA模板濃度，并將模板濃度按1、10、102、103、104倍數(shù)稀釋成系列濃度梯度，用引物sfs5-1/sfs5-2進行PCR擴增檢測其靈敏性。PCR體系及反應(yīng)條件同“1.5”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的選擇

通過桑粉虱與NCBI數(shù)據(jù)庫公開的共7種粉虱COⅠ基因序列對比分析，設(shè)計桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，上游引物sfs5-1為5′-GTGGATTTGGGAACTGACTA-3′，下游引物sfs5-2為5′-GTGACATTCCTAAGGTTCGT-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物為300 bp。

2.2 引物特異性驗證結(jié)果

選擇引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱及桑園周邊煙粉虱B型、溫室白粉虱基因組DNA進行PCR擴增，電泳檢測結(jié)果表明，桑粉虱基因組DNA均可擴增出約300 bp目的條帶，而煙粉虱及溫室白粉虱基因組DNA未見目的條帶（圖1）。3種粉虱各重復(fù)5頭成蟲基因組擴增得到的結(jié)果一致，說明引物sfs5-1/sfs5-2在3種粉虱中具有桑粉虱種的特異性。

2.3 引物靈敏性檢測

引物sfs5-1/sfs5-2對桑粉虱幼蟲及卵基因組均可擴增出約300 bp目的條帶，說明設(shè)計的引物對桑粉虱卵、幼蟲、成蟲各蟲態(tài)具有良好擴增能力（圖2）。桑粉虱DNA模板按1、10、102、103、104倍數(shù)稀釋后分別得到1.5 ng/μL、0.15 ng/μL、15 pg/μL、1.5 pg/μL、0.15 pg/μL系列梯度濃度，經(jīng)過引物sfs5-1/sfs5-2 的PCR擴增、靈敏度檢測，表明該引物對模板濃度的最低檢測值為 0.15 ng/μL，引物靈敏性較高（圖3）。

3 結(jié)論與討論

對于形態(tài)特征不穩(wěn)定或多變異性的昆蟲，特別是近緣種的區(qū)別和疑難種的鑒定，PCR擴增分子標(biāo)記技術(shù)可解決傳統(tǒng)形態(tài)分類難以解決的難題且不受蟲態(tài)影響[6，8]。其中線粒體COⅠ基因已廣泛用于近緣種間系統(tǒng)進化研究，并已應(yīng)用于粉虱、蚜蟲等多種昆蟲新物種鑒定[9-11]。基于線粒體COⅠ

基因序列分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來的種特異性鑒定技術(shù)，在擴增未知DNA模板時可根據(jù)目標(biāo)片段的有無將目標(biāo)種類與其他種類鑒別開，由于該技術(shù)操作簡便，在粉蚧、實蠅、小蠹蟲、線蟲等害蟲的快速鑒定中被廣泛應(yīng)用[12-15]。針對較多隱種分化的煙粉虱，通過對多個隱種mtCOⅠ序列限制性內(nèi)切酶位點分析，篩選特定的內(nèi)切酶，利用mtCOⅠPCR-RFLP技術(shù)成功鑒定了國內(nèi)9個煙粉虱隱種[16]。應(yīng)用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)篩選出溫室白粉虱特異性片段，由此片段設(shè)計特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）特異引物可將溫室白粉虱與其他種粉虱區(qū)別開，提高了溫室白粉虱檢測效率[17]。對于入侵性螺旋粉虱、雙鉤巢粉虱，采用其mtCOⅠ基因種的特異性序列，設(shè)計各自特異性引物，通過PCR擴增、檢測，成功將靶標(biāo)粉虱與其他種粉虱區(qū)別開，為口岸檢疫、害蟲檢測及監(jiān)測提供了快速分子鑒定技術(shù)[18-19]。

云南蒙自桑園及周邊不同寄主植物粉虱種群鑒定表明，桑樹上僅有桑粉虱1種粉虱害蟲危害；遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育聚類分析得出，不同于煙粉虱、溫室白粉虱等多種粉虱，桑粉虱作為獨立分枝存在[7]。東桑西移，伴隨云南省桑園面積擴大，桑粉虱在該省的危害日趨嚴(yán)重。建立科學(xué)、簡便、高效的桑粉虱檢測技術(shù)，對粉虱危害季節(jié)的桑粉虱鑒定、種苗調(diào)運過程害蟲檢測、種群遷移擴散監(jiān)測及防控機制研究等有重要的科學(xué)意義。

本研究根據(jù)與桑粉虱親緣關(guān)系較近的6種粉虱mt COⅠ堿基序列，設(shè)計桑粉虱特異性引物sfs5-1/sfs5-2，并建立桑粉虱快速分子檢測技術(shù)。該引物可將桑粉虱與桑園周邊多發(fā)性的煙粉虱、溫室白粉虱區(qū)別開，并且對桑粉虱單頭成蟲、卵粒、幼蟲均具擴增能力，產(chǎn)生目的片段約為300 bp。引物靈敏度高，桑粉虱基因組DNA模板最低檢測值為0.15 ng/μL，可用于痕量或可疑蟲態(tài)的桑粉虱檢測。煙粉虱、溫室白粉虱是世界性害蟲。螺旋粉虱是1種入侵性害蟲，我國臺灣有64科144種植物受害，海南省有47科120種植物受害[20]。番荔枝褶粉虱、番石榴黑棒粉虱、伯粉虱在國內(nèi)尚未見報道。本試驗檢測樣本種類有限，僅涉及桑粉虱及廣泛分布危害的煙粉虱、溫室白粉虱，桑粉虱種特異檢測還需更多地域、更多種類粉虱樣本進行驗證。

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