外源苯甲酸對煙草幼苗素質及生理生化的影響

李理+李鑫+周冀衡

摘要： 通過在K326煙草品種幼苗生長過程中施加不同濃度苯甲酸處理液，分析苯甲酸處理液對煙草幼苗物理產量、結構及生理化學反應等主要指標的影響。結果表明：苯甲酸處理液在低濃度（0～400 μmol/L）范圍內能夠通過提高煙草幼苗生物量、根系結構、根系活力、光合特性、葉綠素含量以及葉綠素熒光參數等重要指標促進煙草幼苗生長；高濃度（800～1 000 μmol/L）范圍內降低煙草幼苗生物量、根系結構、光合特性及葉綠素含量來抑制煙草幼苗生長；中間濃度（400～600 μmol/L）范圍內，苯甲酸液可以促進煙草幼苗生長。

關鍵詞： 苯甲酸；煙草；幼苗生物量；生理生化；葉綠素熒光；根系活力

中圖分類號： S572.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0124-04

研究表明，作物根系分泌物中含有自毒物質，這些物質主要是酚類物質[1-4]。水稻秸稈腐解以及根系分泌物中的自毒物質包括對羥基苯甲酸、香豆酸、丁香酸、香草酸、杏仁酸、阿魏酸等[5]。吳鳳芝等從多種蔬菜的根系分泌物中分離出數十種酚酸類物質，其中有93.7%的物質有不同程度的毒性，對羥基苯甲酸、苯丙烯酸毒性最為強烈[6]。大豆根系分泌物中的對羥基苯甲酸、香豆酸、香豆醛直接抑制大豆幼苗的生長[7]。Yu從黃瓜根系分泌物中鑒定出了對羥基苯甲酸、苯甲酸、苯丙烯酸等多種酚酸類物質，這些物質對黃瓜根系養分的吸收等生理活動以及幼苗生長有直接影響[8]。本試驗探討苯甲酸對煙草幼苗生理生化特性的影響，旨在為減輕煙草連作帶來的土壤環境惡化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為K326（Nicotiana tobacum L. K326），由貴州省煙草科學研究院提供。苯甲酸標準品由貴州省煙草科學研究院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度苯甲酸處理的稀釋 稱取定量苯甲酸，用去離子水將其分別配制成200、400、600、800、1 000 μmol/L 5個濃度處理液，并以去離子水為空白對照（CK），4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 試驗設計 幼苗生長試驗于2014年4月至2014年8月進行，在貴州省煙草科學研究院頂層育苗大棚中進行育苗，采用育苗盤（12孔/盤，規格：長190 mm×寬145 mm，孔徑35 mm，孔深45 mm）育苗，育苗基質由廣州肥苗農業科技有限公司提供。4月1日播種，育苗15 d后間苗（4月 15日），育苗后每穴留1株煙苗，后向育苗盤中每天18：00澆灌 100 mL 對應濃度的苯甲酸處理液。采用隨機區組設計，共設6個處理（包括CK處理），每個處理3次重復（即3盤幼苗），每個重復12株。6個處理分別與苯甲酸液濃度對應，為CK（0 μmol/L）、200、400、600、800、1 000 μmol/L處理。待煙草生長60 d（6月1日）后測量生物量、根系形態結構、根系活力、過氧化酶類、光合指標、相對葉綠素、葉綠素熒光等指標。

1.3 測定項目

1.3.1 幼苗生物量測定 測量鮮質量時用蒸餾水將幼苗清洗干凈，用吸水紙吸干，在百分之一天平上測量，在105 ℃熱風循環烘箱中烘烤30 min，測定干質量，干鮮比直接計算到小數點后兩位。每處理測3株，3次重復（下同）。

1.3.2 幼苗根系結構測定 將選取的幼苗洗凈后直接將其根部剪掉，再次進行沖洗，待洗凈后編號規則放入數字化掃描儀（ EPSON Expression 1000XL），按照WinRHIZO 根系分析系統專業版2009b的使用手冊進行掃描，用WinRHIZO根系分析系統軟件（ Regent Instruments Canada Inc. ）對根系圖進行根系總長度、總根表面積、總根體積、根尖數、根平均直徑、根系交叉數測量和分析。根系測定時各處理選取長相一致、具有代表性的煙苗根系。

1.3.3 幼苗根系活力的測定 待煙草幼苗生長60 d，每處理取相同部位的鮮根系，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水漂洗，最后用吸水紙吸干水分，采用氧化三苯基四氮唑（TTC）[9]測定活力。

1.3.4 POD、SOD活性及MDA含量測定 分別采用南京建成生物工程研究所生產的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒測定。

1.3.5 幼苗光合指標的測定 采用LI-6400便攜式光合指標測定儀測定幼苗凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cond）、蒸騰速率（Tr）和細胞間隙二氧化碳濃度（Ci）。在每株煙苗相同部位選取1張煙葉（從下到上數第4張功能葉）。

1.3.6 幼苗相對葉綠素值的測定 用葉綠素儀SPAD-502測定選定煙苗功能葉的相對葉綠素含量，待測定的每株煙苗在相同部位選取1張煙葉（從下向上數第4張功能葉）。

1.3.7 葉綠素熒光參數測定 待測定葉片經暗適應30 min后，采用M系列IMAGING-PAM（德國WALZ公司）調制葉綠素熒光成像系統，選擇煙苗第 2～3張葉自上而下測定葉綠素熒光動力學參數。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2003軟件處理數據，采用DPS 9.05軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗生物量的影響

由表1可以看出，不同濃度苯甲酸對煙草幼苗生物量各類指標總體呈現低濃度促進高濃度抑制的趨勢。其中幼苗葉鮮質量在200 μmol/L濃度處理下呈增加趨勢，但與對照處理無顯著性差異，在600 ～1 000 μmol/L濃度處理下呈降低趨勢，且與對照處理差異顯著；根鮮質量與葉鮮質量表現類似趨勢，在200～400 μmol/L濃度處理下均表現增加趨勢，600～1 000 μmol/L濃度處理下抑制根生長，與對照處理差異不顯著；葉干質量在200～400 μmol/L濃度處理下一直呈增加趨勢，在600 ～1 000 μmol/L濃度處理下一直呈降低趨勢，且在1 000 μmol/L濃度處理下抑制達到最低；根干質量在不同濃度處理下的變化趨勢與根鮮質量一致，在1 000 μmol/L濃度處理下抑制程度達到最大，且與對照處理差異不顯著；鮮干比越大表示鮮質量越大，干質量越小，生物量積累量越小。

2.2 不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗根系形態結構的影響

由表2可以看出，不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗根系結構中的根系總長度、總根表面積、總根體積、根尖數、根系平均直徑的影響趨勢相同。隨著苯甲酸濃度的不斷增加，煙草幼苗根系總長度、總根表面積、根尖數在600 μmol/L濃度處理下達到最大，分別是對照的1.10、1.07、1.19倍；煙草幼苗根系總根體積在1 000 μmol/L濃度處理范圍內總體呈先促進后抑制的趨勢，在400 μmol/L濃度處理下達到最大，后逐漸呈現抑制態勢，在1 000 μmol/L濃度處理下抑制程度達到最大，僅為對照的89%；煙草幼苗根系平均直徑總體也呈低濃度促進高濃度抑制的趨勢，但是促進作用不明顯，與對照無顯著性差異；1 000 μmol/L濃度處理下煙草幼苗根系平均直徑為對照的62.5%。

2.3 不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗根系活力的影響

植物根系是活躍的吸收器官、合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響植株地上部分的營養狀況及產量水平，是表征植物根系的量，其活力提高對煙葉的光合強度和葉綠素含量均有十分重要的意義[10]。從圖1可以看出，各處理間煙草幼苗根系活力表現為400 μmol/L>200 μmol/L>CK>600 μmol/L>800 μmol/L>1 000 μmol/L，不同濃度苯甲酸處理下對煙草幼苗根系活力呈現出的抑制作用明顯大于促進作用，在1 000 μmol/L時抑制作用最大，在400 μmol/L濃度處理內根系活力一直呈增加趨勢，煙草幼苗根系最大活力為 4.75 μg/（g·h），隨著苯甲酸濃度增加，抑制作用逐漸增強。

2.4 不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗酶活性的影響

從表3可以得出，煙草SOD、POD分別在200、400 μmol/L濃度下達到最大，分別為3.33、15.22 U/mg，與對照差異不顯著，均在 1 000 μmol/L 濃度時達到最大抑制程度，分別為1.37、7.41 U/mg。煙草幼苗MDA含量在1 000 μmol/L濃度范圍內呈先降低后增大的趨勢，在400 μmol/L時降低到最小，然后隨著苯甲酸濃度的不斷增大，MDA含量一直呈增加趨勢，1 000 μmol/L時MDA含量達0.85 nmol/mg，與CK處理差異顯著。

2.5 不同濃度苯甲酸處理對煙草幼苗光合特性的影響

由表4可知，不同濃度苯甲酸處理液下煙草幼苗凈光合速率、氣孔導度變化趨勢類似，低濃度處理下起促進作用，高濃度處理下受到抑制。1 000 μmol/L濃度下抑制程度達到最大。煙草幼苗蒸騰速率在800 μmol/L濃度范圍內一直呈增加趨勢，在800 μmol/L濃度時與CK無差異，1 000 μmol/L濃度時則降到1.79 mmol/（m2·s），與其他各處理間差異顯著。胞間CO2濃度在1 000 μmol/L濃度范圍內隨苯甲酸濃度的不斷增加呈現促進趨勢，1 000 μmol/L濃度處理下達到300.5 μmol/ mol，為對照的111.58%。

2.6 不同苯甲酸濃度處理對煙草幼苗葉綠素含量的影響

相對葉綠素含量（SPAD值）與葉綠素濃度、葉片全氮濃度之間有穩定的極顯著相關性，可間接反映煙草的氮素營養狀況[11]。從圖2可以看出，當苯甲酸濃度為600 μmol/L時，煙草幼苗相對葉綠素含量最大，是CK處理的1.25倍，且差異顯著；當苯甲酸濃度為1 000 μmol/L時，煙草幼苗相對葉綠素含量為26.27，與CK差異不顯著。其他處理間煙草幼苗相對葉綠素含量無顯著差異，且與CK差異不顯著。

2.7 不同苯甲酸濃度處理對幼苗葉綠素熒光的影響

PSⅡ最大光化學量子產量（Fv/Fm） 反映了反應中心內稟光能轉換效率或稱最大PSⅡ的光能轉換效率[12]。非脅迫條件下PSⅡ最大光化學量子產量的變化極小，不受物種和生長條件的影響，脅迫條件下該參數明顯下降，當該參數值下降時則表明植物受到脅迫，參數下降越明顯，植物受到的脅迫越大[13-14]。由表5可以看出，CK的Fv/Fm與200、400、600、800 μmol/L濃度處理無顯著差異，分別為0.63、0.62、0.63、0.65，1 000 μmol/L苯甲酸濃度處理時煙草幼苗葉片Fv/Fm只有0.58，受到的脅迫較大，且與CK處理差異顯著，說明在1 000 μmol/L苯甲酸濃度范圍內，低濃度苯甲酸處理下幼苗葉片PSⅡ具有較高的光能轉換效率，高濃度苯甲酸處理下幼苗葉片PSⅡ具有較低的光能轉換效率。

光化學淬滅系數（qP）是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額，較低的光化學淬滅系數反映PSⅡ中開放的反應中心和參與二氧化碳固定的電子減少[15]。由表5可以看出，CK光化學淬滅系數值高于400 μmol/L苯甲酸處理，兩者差異不顯著。200 μmol/L苯甲酸處理下煙苗qP高于對照，且差異顯著。600、800、1 000 μmol/L苯甲酸處理下幼苗qP顯著低于對照，分別只有0.28、0.34、0.29。說明低濃度苯甲酸處理下qP提高了光合作用中二氧化碳固定電子的能力，高濃度苯甲酸處理下降低了光合作用中二氧化碳固定電子的能力，脅迫作用越強，二氧化碳固定電子能力越弱。

調節性能量耗散量子產量（YNPQ）是光保護的重要指標，若YNPQ較高，一方面表明植物接收的光強過剩，另一方面說明植物仍可以通過調節作用（如將過剩光能耗散為熱）來保護自身[16]。由表5可以看出，隨著苯甲酸濃度不斷增大，YNPQ也隨之增大。1 000 μmol/L苯甲酸處理下煙草幼苗葉片YNPQ達到最大，且與對照差異顯著。說明在一定苯甲酸濃度處理范圍內，煙草幼苗葉片接收的過剩強光較多，吸收的光量子很少通過光化學途徑轉化為能量。

PSⅡ實際光合效率（YⅡ）表示植物將吸收光能進行轉化的能力。從表5可以看出，對照YⅡ與其他所有濃度處理均大，且差異顯著，1 000 μmol/L苯甲酸處理下煙草幼苗達到最小，說明苯甲酸降低了幼苗葉片PSⅡ反應中心的實際光合能力。

3 結論與討論

根系分泌物對作物的化感作用復雜多變，不同環境下不僅對不同植物具有選擇性、專一性，而且對同一植物高濃度和低濃度化感作用存在差異，并且多種成分符合化感效應有所不同[17]。本研究結果表明，不同濃度苯甲酸對煙草幼苗生長過程中各項生理生化等指標的影響規律大體相似，均表現為低濃度促進高濃度抑制。這一結論與李翠香等的研究結論[18]相似。藺琰東等研究表明，苯甲酸對馬鈴薯組培苗有明顯抑制作用，且隨著化感物質濃度的增加，當多種抑制物質同時培苗時抑制作用更明顯[19]。Choesin等認為，較低含量的化感物質可以促進植物的生長[20]。本研究結果表明，在1 000 μmol/L苯甲酸濃度范圍內，對K326品種煙草的多種生理生化指標測定中起主要促進作用的濃度集中在400～600 μmol/L范圍內。孫穎穎等研究對羥基苯甲酸對赤潮微藻—米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻生長的影響，結果表明，當對羥基苯甲酸濃度>1.6 mmol/L時，對羥基苯甲酸能明顯抑制2種微藻的生長[21]。韓春梅研究認為，隨著苯甲酸濃度的增加，白菜幼苗的根長和苗長均呈降低趨勢[22]。本研究結果表明，苯甲酸在0～400 μmol/L濃度范圍內的幼苗根系生長中，表現為根尖數、總根長、根表面積、根體積增大，與前人研究結果類似，主要原因是較低濃度的苯甲酸處理引起幼苗代謝出現異常，導致脂類化合物增加，或者是由于自毒物質導致植物不能有效利用營養物質和代謝途徑的一種自我保護機制[23-25]。隨著苯甲酸濃度的不斷增大，煙草的自我保護機制受到破壞，直接影響根系的生長，600～1 000 μmol/L苯甲酸處理對煙草幼苗的葉綠素含量有抑制作用，影響葉綠素的生長合成。相對葉綠素含量直接表征葉片內的氮含量，硝酸還原酶是硝基同化過程中的關鍵酶，也是植物體內同化硝酸鹽過程的限速酶，其活性強弱與植物體內的氮同化能力密切相關[26-27]。本試驗中，高濃度苯甲酸處理液通過抑制硝酸還原酶的活性來影響氮同化，進而抑制幼苗相對葉綠素含量和與相對葉綠素有關的光合作用以及葉綠素熒光等反應。SOD、POD 2種過氧化物酶在低濃度下促進煙草幼苗生長，高濃度下抑制其生長，這主要是由于在低濃度苯甲酸液下煙草幼苗可以通過增加POD、SOD等活性酶清除活性氧維持自身穩定的內環境，當苯甲酸濃度過高時脅迫作用加大，產生的毒害效應直接導致POD、SOD下降，MDA直接表征幼苗受到的脅迫作用強弱，當幼苗受到外界的脅迫作用較弱時，MDA含量較低，當脅迫作用較大時，MDA含量增大，自由基含量也不斷增多。自由基可以直接攻擊葉綠素，導致葉綠素遭到破壞[28]，光合作用場所發生在葉綠素類囊體膜上，葉綠素降解必將導致光合速率下降。高濃度苯甲酸可以降低光合作用中的關鍵反應酶RuBP羧化酶的活性，直接導致光合速率下降[29]。本試驗只研究了0～1 000 μmol/L濃度范圍內的苯甲酸對煙草幼苗生物量、根系物理結構生長、根系活力、相對葉綠素含量、葉綠素熒光特性、光合特性影響，所得出的結論有一定的局限性，由于本試驗均是在煙草幼苗期的理想環境下進行的，對苯甲酸應用于大田成熟期的情況勢必會有一些外界因素造成干擾和影響，且大田成熟期是否能通過煙草自身的生理反應消除這種障礙還需要進一步探討。

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