鹽溶蛋白電泳和SSR標(biāo)記鑒定蘇玉20種子純度的比較研究

王波+彭宏+羅緒標(biāo)+郭玲

摘要： 為建立一套經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒定蘇玉20純度的方法，利用鹽溶蛋白電泳和SSR標(biāo)記同時對該品種進(jìn)行了純度鑒定，并對2種方法及結(jié)果進(jìn)行了比較分析。研究發(fā)現(xiàn)，同一批次種子，2種方法純度結(jié)果基本一致，但鹽溶蛋白電泳法純度結(jié)果比SSR分析結(jié)果平均高0.78百分點(diǎn)。經(jīng)綜合分析，在實(shí)際操作中，建議用SSR標(biāo)記，利用1～2對引物即可完成蘇玉20 的純度鑒定，其結(jié)果更真實(shí)準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞： 玉米種子；蘇玉20；鹽溶蛋白；SSR標(biāo)記；純度鑒定

中圖分類號： S513.037 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0072-02

鹽溶蛋白電泳一直是種子企業(yè)鑒定玉米種子純度的主要方法之一。該方法簡單、便于操作，對技術(shù)人員和檢驗(yàn)設(shè)備要求不高，一般的種子企業(yè)檢驗(yàn)室都可開展該項(xiàng)工作，因此在實(shí)際檢驗(yàn)工作中被廣泛應(yīng)用。包和平等利用玉米鹽溶蛋白PAGE法和田間小區(qū)種植鑒定法對吉林省生產(chǎn)商應(yīng)用的16個雜交玉米種子純度進(jìn)行測定，試驗(yàn)表明，同一樣品種子純度田間小區(qū)鑒定普遍高于蛋白PAGE法鑒定純度值，純度越高2種方法所測值偏差越小[1]。郭景倫等將玉米雜交種子純度室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果進(jìn)行了對比研究，結(jié)果表明，2種方法鑒定結(jié)果較吻合，一般相差在5.0%以內(nèi)，并且玉米種子純度越高，室內(nèi)鑒定結(jié)果和田間鑒定結(jié)果相差越小；純度越低，2個結(jié)果差異越大[2]。

但鹽溶蛋白PAGE法有一定的局限性，有些品種雙親蛋白質(zhì)水平上的差異較小，難以鑒定；鑒定大批量玉米種子純度時，藥品配制量大且步驟繁瑣，有些試劑容易失效；另外鹽溶蛋白的電泳譜帶分辨率低，有時會出現(xiàn)誤讀或譜帶難以辨別，因此對結(jié)果判定有一定的影響。近幾年來隨著SSR分子標(biāo)記的發(fā)展和應(yīng)用，表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)越性。孟慶長等以蘇玉20雜交種及其親本為材料，篩選出在蘇玉20雙親之間多態(tài)性明顯、重復(fù)性較好的4對引物bnlg1306、phi065、bnlg2291和umc1590用于蘇玉20鑒定[3]。此標(biāo)記特異性好，田間鑒定與利用SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果高度一致。本試驗(yàn)利用孟慶長等篩選的4對引物，結(jié)合鹽溶蛋白電泳法對蘇玉20種子純度進(jìn)行鑒定，并比較分析，驗(yàn)證2種試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性，以便建立一套適應(yīng)蘇玉20品種純度準(zhǔn)確、快速鑒定的試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇玉20雜交種及其親本蘇951和蘇651種子均由江蘇明天種業(yè)科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 鹽溶蛋白電泳法 參照NY/T 449—2001《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記 切取少量胚乳，利用堿煮法[4]提取玉米基因組DNA。利用文獻(xiàn)[3]中提供的4對引物（表1）用于蘇玉20純度鑒定，所用引物由上海英俊生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL，Super Taq Mix 5.0 μL（上海浦迪生物科技有限公司），ddH2O 3.0 μL，上下游引物（2.0 μmol/L）各0.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在BIO-RAD 5808R型PCR儀上進(jìn)行。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物在30%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（N，N-亞甲基二丙烯酰胺 ∶丙烯酰胺=1 ∶29）分離1.5 h后，經(jīng)0.2% AgNO3銀染后顯色，拍照觀察并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽溶蛋白及SSR分子標(biāo)記電泳結(jié)果參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 449—2001《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》，將待檢批次的蘇玉20及其父、母本蛋白質(zhì)上樣，電泳并分析（圖1）。結(jié)果表明：蘇玉20及其親本自交系間存在差異，且雜交種F1代和雙親譜帶互補(bǔ)。圖1中，有1個泳道的譜帶呈偏母本型，可能是母本接受外來花粉造成的混雜，可以確定為非雜交種。這表明鹽溶蛋白電泳可用于蘇玉20品種純度鑒定。

利用孟慶長等篩選出的4對引物[3]對蘇玉20雜交種及親本進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物umc1590經(jīng)PCR擴(kuò)增后，F(xiàn)1代圖譜出現(xiàn)3條互補(bǔ)帶，因此不建議作為區(qū)分此品種的首選引物。而引物bnlg1306、phi065、bnlg2291經(jīng)PCR擴(kuò)增后父母本各為1條帶，雜交種為雙親的2條互補(bǔ)帶，可很好地區(qū)分（圖2）。

2.2 2種方法的結(jié)果比較

對10個不同批次種子同時用2種方法進(jìn)行對比（表2），研究發(fā)現(xiàn)，同一批次種子，蛋白電泳純度數(shù)值比SSR分子標(biāo)記數(shù)值高平均0.78百分點(diǎn)，差異范圍在-0.8～3.1百分點(diǎn)。2種方法數(shù)值有一定的相關(guān)性，種子純度越高，2種方法數(shù)值越接近，如果純度越低，SSR分子標(biāo)記數(shù)值相對越低。

為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的3對引物能否很好地鑒定品種純度，每一粒種子經(jīng)玉米單粒磨碎儀研磨后，取少許胚乳做DNA模板，對應(yīng)的種胚做鹽溶蛋白電泳。經(jīng)比較，2種方法的純度結(jié)果基本吻合（表3）。另外研究發(fā)現(xiàn)，152個檢測樣品，4個母本自交系種子在不同引物標(biāo)記及蛋白電泳檢測中表現(xiàn)均一致，而經(jīng)phi065檢測顯示為父本的個體在其他方法中顯示為F1代，經(jīng)bnlg1306和蛋白電泳檢測顯示為雜株的個體在其他檢測方法中顯示為F1代。這種現(xiàn)象可能和玉米種子在不同發(fā)育時期蛋白表達(dá)不同有關(guān)。同時也說明在實(shí)際工作中，應(yīng)結(jié)合該批種子是自交苗、回交苗、其他類型雜株還是遺傳不穩(wěn)定因素，根據(jù)實(shí)際情況，選擇合適的引物對，對各單株檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判定，確定待測雜交種的純度。

3 討論與結(jié)論

劉宏魁等利用鹽溶蛋白PAGE法和SSR分子標(biāo)記對先玉335和澤玉11指紋圖譜進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)，鹽溶蛋白法可大批量用于純度檢測，對于難以鑒定的品種可用SSR分子標(biāo)記法作為輔助手段進(jìn)行鑒定[5]。本試驗(yàn)以同一玉米種子為材料，提取不同取樣部位的基因組DNA，利用SSR分子標(biāo)記法和鹽溶蛋白電泳法對蘇玉20純度進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明2種方法均可區(qū)分親本自交系和雜交種。這說明堿煮法適于蘇玉20的提取，鹽溶蛋白電泳法也可以用于此品種的純度鑒定。

試驗(yàn)中利用3對SSR引物和蛋白電泳進(jìn)行比較（表3），研究發(fā)現(xiàn)2種方法結(jié)果比較吻合。但各個引物的SSR標(biāo)記圖譜和蛋白電泳圖譜個別個體表現(xiàn)并非一一對應(yīng)，這正解釋了SSR標(biāo)記作為一種隨機(jī)DNA標(biāo)記，個體在不同引物間存在一定差異，而SSR 標(biāo)記和鹽溶蛋白法個體的差異表現(xiàn)正說明蛋白質(zhì)電泳圖譜易受種子（或幼苗）發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響，不夠穩(wěn)定從而影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。這和趙久然的研究結(jié)果[6]是一致的。

參考文獻(xiàn)：

[1]包和平，曹麗娟，楊 光. 用鹽溶蛋白PAGE法檢測雜交玉米種子純度[J]. 中國種業(yè)，2006（6）：36-37.

[2]郭景倫，趙久然，王風(fēng)格，等. 玉米雜交種純度室內(nèi)與田間鑒定結(jié)果比較研究[J]. 種子世界，2004（7）：22-24.

[3]孟慶長，陳艷萍，楊興華，等. 利用SSR技術(shù)鑒定蘇玉20的純度[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（3）：508-512.

[4]王建華，田寶華，楊麗維，等. 玉米單粒播種子質(zhì)量評價與檢測技術(shù)手冊[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子科學(xué)與技術(shù)研究中心，46-52.

[5]劉宏魁，閆洪朗，原亞萍. 應(yīng)用鹽溶蛋白電泳和SSR分子標(biāo)記鑒定玉米種子純度的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11396-11398.

[6]趙久然. 玉米種子真實(shí)性和品種純度鑒定新方法[J]. 北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（3）：25-40.