擬南芥葉色突變體F03—06的篩選及突變基因的克隆

摘要：植物光合作用是人類賴以生存的基礎，葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，葉色可作為葉綠體發育狀態的標記，葉色突變體是研究光合作用機制的優良系統。通過EMS誘變篩選得到一個擬南芥葉色突變體F03-06，主要表型為葉片黃綠、葉脈深綠色、生長緩慢、株型矮小。遺傳分析表明，F03-06突變表型受隱性單核基因控制。利用圖位克隆技術，通過粗定位和精細定位發現該突變體表型與擬南芥At5g54810基因的突變體表型相似。對At5g54810基因的測序結果顯示，其+865堿基由鳥嘌呤突變為腺嘌呤，從而使編碼的丙氨酸變為蘇氨酸。At5g54810基因被報道編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基，為進一步研究擬南芥色氨酸合成途徑與葉綠體發育之間的調控機制提供了新的遺傳材料。

關鍵詞：葉色突變體；圖位克隆；葉綠體發育；色氨酸生物合成

中圖分類號：Q37；Q341 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5664-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.057

Genetic Screening and Isolation of a Leaf Color Mutant F03-06 in Arabidopsis

PING Bu-yun，ZHAO Jun，AN Li-jun

（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Life Sciences，Northwest A F University，

Yangling 712100，Shaanxi，China）

Abstract： Photosynthesis that is proceeded in the chloroplast plays key role for human beings survival， leaf color mutants are excellent system to study the mechanisms of photosynthesis because leaf color could be used to mark the chloroplast development status. In an effort to identify genetic factors involved in plant photosynthesis，large scale genetic screening was carried out and one color mutant F03-06 was isolated from a EMS mutagenesis library in Col-0 back ground. Compared with the wild type，F03-06 mutant exhibited smaller pale green rosette leaves， dark veins and also retarded growing and dwarf plant size. Genetic analysis indicated that the F03-06 mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear locus. Based on the map-based cloning approach and DNA sequencing，there was a single nucleotide mutation at the +865th base pair within the gene At5g54810 were found which was reported to encode the β subunit of tryptophan synthetase. In addition，the loss function mutants of At5g54810 exhibit the similar phenotype to that of F03-06，At5g54810 could correspond to the mutation gene in F03-06 background. This work will provide new genetic material for studying and revealing the mutual regulation mechanisms between tryptophan synthesis and chloroplast development.

Key words：leaf color mutant；map-based cloning；chloroplast development；tryptophan biosynthesis

光合作用是地球上規模最大的能量轉換形式，是生物界幾乎所有物種賴以生存的關鍵。葉綠體是植物進行光合作用的重要細胞器，具有半自主性，具備獨立的DNA和蛋白質合成體系[1]。葉綠素是植物葉綠體內參與光合作用的重要色素，由于其對400～700 nm波長范圍內的綠光吸收值低，所以大多數的植物葉片都呈現綠色[2]，但在某些特殊情況下，直接或者間接影響葉綠素的合成或者降解過程，造成植物體內葉綠素的變化，就會使葉色發生變異，形成葉色突變體[3]。葉色突變大致分為白化、黃葉、淺綠、深綠、黃綠、綠黃、條紋和斑點等類型，其突變的分子機制也較為復雜，植物葉綠素合成途徑、血紅素到光敏色素生色團生物合成途徑的任何基因發生突變，都會導致葉色突變體的形成[4]。另外，細胞核編碼的葉綠體基因發生突變也會導致葉色變異[5]。目前，葉色突變體已廣泛應用于基礎理論研究和實踐生產，利用葉色突變體研究植物光合作用機制，以及培育觀賞植物等。因此，發掘和篩選葉色突變體，克隆和鑒定突變基因的生物學功能具有重要的理論意義和實際應用價值。

本研究在大規模遺傳誘變篩選中獲得了一個擬南芥葉色突變體F03-06，該突變體蓮座葉與野生型相比葉色黃綠、葉脈深綠色、葉片較小、呈圓形、葉柄短，植株整體生長緩慢，株型矮小。利用圖位克隆技術[6]，通過粗定位和精細定位以及DNA測序分析，確定該突變基因為At5g54810，它編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基[7，8]，為進一步解釋色氨酸合成途徑與植物葉綠體發育之間的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Columbia（Col-0）和Lansberg erecta（Ler）生態型野生型擬南芥種子由本實驗室保存；Col-0背景的甲基磺酸乙酯（Ethyl methylsulfonate，EMS）突變體庫由本實驗室創制保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料的種植和培養方法 將Col-0背景的EMS誘變庫按pool播種在進口品氏基質泥炭土（Pindstrup Substrate Peat Moss）上，4 ℃處理3 d保證種子發芽的一致性，隨后移入植物生長間培養，培養條件為24 h持續光照，溫度（20±2） ℃，相對濕度70%。培養2周左右待植物長出第3、第4片真葉時觀察葉片顏色，篩選葉色異常的植物作為潛在的葉色突變體。

1.2.2 突變體遺傳背景的純化和遺傳學分析 將挑選出的表型明顯的突變體與野生型Col-0連續回交3次，純化突變體的遺傳背景并獲得BC3種子。同時，在突變體與野生型Col-0回交的過程中，通過觀察雜交F1代植株表型判斷突變的顯隱性；通過統計F2代群體中的分離比判斷該突變體是否由單基因突變造成。另外，通過正反交試驗驗證突變位點是否為細胞核遺傳。

1.2.3 圖位克隆 首先將背景純化的突變體與Ler生態型擬南芥進行雜交，在雜交F2代植株中挑選具有突變體表型的植株作為圖位克隆的作圖群體。通過CTAB法提取約95棵突變體植物DNA并進行混合構建1個DNA混合池，利用已經公布的均勻分布擬南芥5條染色體的27對分子標記為引物進行初步定位。確定突變位點的染色體區間和側翼分子標記后，繼續擴大作圖群體，增加分子標記密度進行精細定位，進一步縮小突變位點所在區間范圍。

1.2.4 候選基因的確定 根據精細定位的區間，從擬南芥基因組數據庫網站（www.arabidops-is.org）上獲得區間內所包含的基因，查看基因注釋信息及相關參考文獻，篩選出候選突變基因，然后對這些候選突變基因設計引物，進行PCR擴增并測序，最終確定出突變位點。

2 結果與分析

2.1 F03-06突變體的獲得及表型分析

在對以Col-0背景構建的EMS誘變庫的篩選過程中，獲得一個葉色突變體，根據命名系統，將其定名為F03-06（代表第三個誘變pool中篩選到的第6個突變體）。通過與Col-0野生型連續回交3次，F03-06的突變表型穩定。與Col-0野生型相比，F03-06突變體葉色黃綠、葉脈深綠色、葉形小圓、葉柄短，植株總體生長緩慢，且株型矮小（圖1）。由于F03-06突變體表型明顯，所以決定克隆突變基因，以期發現調控植物葉綠體發育的新的遺傳因子。

正反交試驗結果顯示，無論是正交還是反交，所獲得的F1代植物均表現與野生型一致的表型，表明突變體為該基因的隱性突變體。且F1自交后代F2中野生型表型與突變體表型個體的分離比為3∶1，符合孟德爾隱性單基因遺傳規律，這說明F03-06突變表型是受隱性的單個核基因控制。

2.2 F03-06突變基因定位

2.2.1 F03-06突變位點的粗定位 將F03-06 BC3突變體植物與Ler生態型擬南芥進行雜交，在雜交F2代植株中挑選具有突變體表型的植株作為圖位克隆的作圖群體。利用已經公布的均勻分布擬南芥5條染色體的27個分子標記（圖2）和突變體DNA混合池bulk進行染色體粗定位，結果發現突變位點與第5條染色體[9]上的分子標記MSG15#1（21 164 861 bp）連鎖較為緊密（圖3）。4條泳道中樣品從左到右依次為bulk、F1、Col-0和Ler，F1、Col-0與Ler作為對照，以bulk為模板的PCR產物在分子標記MSG15#1處只擴增出明顯的Col-0條帶，而其余分子標記處，以bulk為模板的PCR產物均擴增出Col-0與Ler 2條條帶，說明突變位點不與這些分子標記連鎖或者不在這些分子標記附近。

以bulk中的95個突變體DNA為模板，以MSG15#1和新設計的分子標記MNC17#1為引物進行PCR擴增，結果顯示突變位點位于分子標記MSG15#1和MNC17#1之間，所以將分子標記MSG15#1和MNC17#1作為后續定位的側翼分子標記。

2.2.2 突變位點的精細定位 為了進一步縮小突變位點所在的區間，通過在側翼分子標記區間內增加分子標記密度和擴大作圖群體的數量，對F03-06突變位點進行了精細定位。利用已有的擬南芥Col-0生態型和Ler生態型基因組數據庫，在側翼分子標記區間內設計了5個新的插入/刪除（In/Del）分子標記（表1）。以這些分子標記為引物，通過對F2作圖群體中600株突變體表型植物的基因型進行分析，最終將突變基因定位在第5條染色體上分子標記MRB17#1（22 194 518 bp）和MCO15#1（22 401 666 bp）之間（圖4）。該區間的物理距離為207 148 bp，在分子標記MRB17#1和MCO15#1處的交換率分別為0.08%和0.49%。

2.2.3 候選基因的篩選與初步確定 確定了F03-06突變位點所在的區間后，為了進一步確定造成F03-06突變表型的基因，查詢了擬南芥基因組數據庫（www.arabidopsis.org）。分子標記MRB17#1（22 194 518 bp）與MCO15#1（22 401 666 bp）所包含的染色體區間中共覆蓋64個基因。其中基因At5g54810被報道定位在葉綠體中，編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基，并且At5g54810基因的功能缺失突變smo1/trp2-301、trp2-8和trp2-1與F03-06突變體的表型相似，與野生型相比，表現為葉色黃綠、葉脈深色、葉形小圓、葉柄短，整體生長緩慢，株型矮小[10]（圖5）。

根據F03-06突變體的表型及突變位點所在的區間，推測At5g54810基因突變很有可能是造成F03-06突變表型形成的原因。為了證實這個推測，設計了At5g54810基因特異性引物（表2），以F03-06BC3突變體DNA為模板對At5g54810基因進行PCR擴增并對PCR產物進行測序。測序結果顯示，At5g54810基因的第+865處堿基由鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A），從而使所編碼的丙氨酸（A）變為蘇氨酸（T）（圖4、圖6）。這說明At5g54810基因的單堿基突變有可能是造成F03-06突變表型產生的原因，At5g54810有可能就是F03-06突變基因。

3 小結與討論

模式植物擬南芥基因生物學功能的解析對于其他植物功能基因的研究意義重大，其研究方法和思路可以為其他植物特別是農作物和經濟作物中與重要農藝性狀相關的基因功能研究提供參考和借鑒。本研究通過對擬南芥Col-0野生型EMS誘變庫的篩選獲得一個擬南芥葉色突變體F03-06。與野生型相比，該突變體蓮座葉色黃綠，葉形呈小圓形，植株整體生長緩慢，株型矮小。通過圖位克隆和測序，證實F03-06突變體背景中At5g54810基因發生了單堿基突變（第+865處堿基由鳥嘌呤突變為腺嘌呤），由于EMS屬于烷化誘變劑，能使DNA鏈中的鳥氨酸烷基化，烷化的鳥氨酸與胸腺嘧啶配對，代替胞嘧啶，從而在后續的DNA復制中發生堿基替換，即G∶C變為A∶T。對F03-06突變體背景中At5g54810基因的測序結果符合EMS誘變所形成的堿基替換，所以認為F03-06突變表型可能是由于At5g54810基因的單堿基突變所造成的。At5g54810基因也被稱為TBS1，被認為是編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基。色氨酸不僅是合成蛋白質也是合成許多其他植物代謝產物如激素[11]等所必需的，色氨酸合成酶參與色氨酸合成的重要步驟[7]，色氨酸合成途徑受阻在細胞水平上影響細胞伸長、核內復制等過程，在整體水平上也使植株表現出明顯的發育缺陷表型，如植株矮小、葉色黃綠、葉脈深色等。盡管研究者已經觀察到色氨酸合成與植物葉綠體發育之間存在調控關系，但是具體的作用機制仍不明確[12]。

本試驗所獲得的F03-06突變體為進一步研究At5g54810基因的功能提供了新的遺傳材料，為深入研究色氨酸與植物葉綠體發育的調控關系奠定了基礎。

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