凝集素芯片法分析橋本氏甲狀腺炎患者外周血DC細(xì)胞膜糖蛋白的表達(dá)

袁 媛，唐曉磊，張林杰

◇臨床醫(yī)學(xué)研究◇

凝集素芯片法分析橋本氏甲狀腺炎患者外周血DC細(xì)胞膜糖蛋白的表達(dá)

袁 媛1，2，唐曉磊3，張林杰1

目的通過凝集素芯片法篩選橋本氏甲狀腺炎（HT）患者外周血樹突狀細(xì)胞（DC）差異表達(dá)的膜表面糖蛋白，了解其在 HT中的表達(dá)變化。方法通過制備包含有 32種凝集素的凝集素芯片 對 16例 HT患 者和 22例 健 康 者外周血DC細(xì)胞膜表面糖蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析；凝集素耦聯(lián)葡聚糖拉下相應(yīng)差異表達(dá)的糖蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；同時應(yīng)用實時熒光定 量 PCR（qRT-PCR）、Western blot法 和 流 式 細(xì) 胞 術(shù) 對HT患者外周血 DC中該糖蛋白的 mRNA、蛋白表達(dá)及 Galectin-9+DC比 例 進(jìn) 行 分 析。 最 后 通 過 ELISA法 檢 測 DC與CD8+T細(xì)胞孵育上清液中 IFN-γ、穿孔素、顆粒酶 B濃度。結(jié)果凝集素芯片檢測結(jié)果顯示凝集素脫落酸素（ABA）對應(yīng)的糖蛋白在 HT組顯著低于健康組（P＜0.01）。對凝集素ABA耦聯(lián)葡聚糖拉下后洗脫的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，眾多洗脫蛋白中半乳糖結(jié)合蛋白-9（Galectin-9）所占比例較為豐 富；隨 后 通 過 qRT-PCR和 Western blot進(jìn) 一 步 驗 證Galectin-9在 HT組 DC中的表達(dá)低于健康組；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果則顯 示 HT組 DC Galectin-9low比 例 高 于 健 康 組，且 其 均 能較健康組誘導(dǎo) CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生3種高水平殺傷因子。結(jié)論HT患者外周血 Galectin-9lowDC可能與 HT相關(guān)。

橋本氏甲狀腺炎；樹突狀細(xì)胞；凝集素芯片；半乳糖結(jié)合蛋白-9

橋本氏甲狀 腺 炎 （Hashimoto＇sthyroiditis，HT）是一種常見 的 自 身免 疫 性 甲狀 腺 疾 病 （autoimmune thyroid diseases，AITD）。研究［1-2］表明輔助型 T細(xì)胞以及 T調(diào)節(jié)細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）比例或功能失衡均能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞侵入甲狀腺腺體并產(chǎn)生針對自身 抗 原 的 抗 體。樹 突 狀 細(xì) 胞 （dendritic cell，DC）作為一種重要的抗原遞呈細(xì)胞其，還兼?zhèn)湔{(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫的功能［3］。研究［4-6］表明，外周血 DC在系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE）、多 發(fā) 性 硬 化 （multiple sclerosis，MS）、自身免疫性甲狀腺病（autoimmune thyroid disease，AITD）以及其它惡性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。自身免疫病患者體內(nèi)一些異質(zhì)性 DC能夠通過分泌高水平的白介素 12（interleukin 12，IL-12）和 IL-23從而增強 Th1和輔助性 T細(xì)胞 17（T helper cell 17，Th17）細(xì)胞的免疫反應(yīng)［7-8］。凝集素被廣泛用于分析糖復(fù)合物上的糖鏈結(jié)構(gòu)［9］。本實驗參考 ANGELONIS和 RIDET JL的方法，應(yīng)用的凝集素芯片基本原理最終獲得此生物樣品的糖鏈結(jié)構(gòu)信息［10］。該研究擬通過能夠與不同糖型特異性結(jié)合的各種凝集素與高通量微陣列的優(yōu)勢相結(jié)合，對HT患者外周血 DC細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行初步研究，旨在發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的膜糖蛋白，進(jìn)而探索其差異表達(dá)在AITD中的意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 2014年 2月 ～2014年 8月就診的 AITD患者。其篩選條件為初次就診，年齡 25～45（36.8± 4.6）歲，男女性別比為 1∶1；根據(jù) 1975年 fisher提出的 5項診斷指標(biāo)：① 甲狀腺彌漫性腫大；②TGAb、TMAb陽性；③ 血 TSH升高；④ 甲狀腺掃描有不規(guī)則濃聚或稀疏；⑤ 過氯酸鉀釋放試驗陽性。入選16名均有 4項及以上符合；22名健康者來源于體檢人群，年齡 25～45（32.6±5.1）歲，男女性別比為1∶1，均不符合上述 5項中任何一項。

1.2 主要試劑及儀器32種凝集素分別購自美國Sigma公司、美國 EY公司和美國 Vector公司；細(xì)胞膜提取試劑盒購自長沙碧云天生物公司；Cy3-NHS蛋白標(biāo)記熒光染料購自美國 Lumina公司；大鼠抗人Galectin-9抗體購自美國 Abcam公司；環(huán)氧基芯片、芯片點樣儀和芯片掃描儀均購自北京博奧芯片生物有限公司；質(zhì)譜分析由上海中科新生命有限公司承做。FcR阻斷劑及半抗原（青霉素 G）以及抗青霉素G半抗原抗體均購自上海華壹生物公司。

1.3 方法

1.3.1外周血 DC的分離 使用 Ficoll分離液分離HT組和健康組人群的全血，每組各 100 ml全血得到 6×108／L外 周 血單個核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC），加入 FcR阻斷劑以及聯(lián)有半抗原的抗體混合液，4℃混勻孵育 20min，3 000 r／min離心 10 min，洗去多余的半抗原抗體復(fù)合物，再以磁珠耦聯(lián)的針對半抗原的抗體與之4℃混勻孵育 20 min，通過磁力架吸附后，緩沖液沖洗、收集細(xì)胞懸液，即富含 DC的細(xì)胞懸液。將該懸液與磁珠耦聯(lián)的抗人 CD4+單克隆抗體 4℃混勻孵育 20 min，通過磁力架吸附后棄上清液，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞收集，共計 1.5×107／L細(xì)胞［11］。

1.3.2DC細(xì)胞膜蛋白的熒光標(biāo)記 按照購買的Cy3-NHS操作說明進(jìn)行。

1.3.3凝集素芯片制備與檢測 將 32種凝集素使用無菌 PBS配制為 1 mg／m l，使用芯片點樣儀將配制的凝集素點于環(huán)氧基玻片上，4℃、濕度 60%孵育過夜，封閉液封閉芯片后，加入 Cy3標(biāo)記的 DC細(xì)胞膜蛋白，4℃、濕度 60%孵育 1 h，PBST洗滌后置入芯片掃描儀檢測熒光強度［12-13］。

1.3.4DC細(xì)胞膜蛋白提取與拉下分析 Sephadex

耦聯(lián)凝集素 ABA，將提取的細(xì)胞膜蛋白調(diào)至 5 mg／m l與 100μl Sephadex耦聯(lián)凝集素 ABA充分混合，室溫下結(jié)合 1 h，PBS洗滌 sephadex結(jié)合物，將其結(jié)合蛋白加入 Galβ1、4GalNAc競爭性洗脫結(jié)合的糖蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.5qRT-PCR檢測 將收集的 DC使用 TRIzol處理后提取總 RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取 mRNA逆 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA，設(shè) 計 Galectin-9引 物 （F：5′-CATCCAAGTCCATCCTCCTGTC-3′；R：5′-TGAGCTTCACACAAGATCCACAC-3′）進(jìn)行 94℃ 2 min，94℃ 45 s，61℃ 40 s，72℃ 1 min，共 28個循環(huán)后，72℃ 5min；擴增產(chǎn)物為 235 bp，同時設(shè)置 β-actin作為參照。

1.3.6DC膜 Galectin-9的檢測 Western blot：取每個個體的等量 DC，將 HT組和健康組檢測對象進(jìn)行組內(nèi)隨機組合，每組個體隨機分為 3個小組，將提取的細(xì)胞膜蛋白調(diào)至 1 mg／m l，加入等體積上樣緩沖 液，100℃ 加 熱 3 min，SDS-PAGE電 泳 后 轉(zhuǎn) 至PVDF膜，5%脫脂奶粉 4℃封閉過夜，使用大鼠抗人 Galectin-9抗體結(jié)合 37℃ 1 h，HRP-羊抗大鼠 IgG作為二抗 37℃ 1 h，每次均需要 TBST洗滌 3次，每次 5 min，最后加入化學(xué)發(fā)光底物顯影；流式細(xì)胞術(shù)：使用 FITC-抗人 CD-11c與 APC-抗人 Galectin-9與PBMC室溫下避光孵育 20 min，PBS洗滌 2次后上機檢測，比較 DC Galectin-9low比例。

1.3.7DC Galectin-9low對 CD8+T細(xì) 胞殺傷作用的影響 取臍帶血分離 CD8+T細(xì)胞，將 HT組和健康組 DC分別與 CD8+T細(xì)胞 1：5混合，與終濃度 100 ng／ml LPS共同孵育 12 h，同時設(shè)置 CD8+T細(xì)胞與LPS對照組，使用 ELISA試劑盒分別檢測培養(yǎng)上清中干 擾 素 -γ（interferon-γ，IFN-γ）、穿 孔 素（Perforin）、顆粒酶 B（Granzyme B）的相對濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理使用 SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較使用 t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝集素芯片檢測芯片經(jīng)掃描后對熒光值進(jìn)行計算，結(jié)果顯示凝集素 AAL、LCA、PTL、RCA120、GS-I-A4、NPA、ABA、PSA對應(yīng)結(jié)合 DC膜表面糖蛋白在 HT組中表達(dá)低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而凝集素 STL、DBS、HHA對應(yīng)結(jié)合 DC膜表面糖蛋白在 HT組中表達(dá)高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；比較兩組中凝集素結(jié)合糖蛋白之間差異，凝集素 ABA對應(yīng)結(jié)合的 DC膜表面糖蛋白的熒光值差異高達(dá) 1.89倍。見圖1。

圖1 DC膜糖鏈的凝集素芯片檢測結(jié)果與健康組比較：*P＜0.05

2.2 拉下檢測與鑒定結(jié)果使用 Galβ1、4GalNAc競爭性洗脫 sephadex偶聯(lián) ABA結(jié)合的 DC膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示 Galectin-9為主要含量蛋白。見圖2。將提取的 DC膜蛋白與 ABA結(jié)合后剩余蛋白以及競爭洗脫蛋白行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色顯示在 35 ku處有明顯條帶，隨后使用Western blot法鑒定凝集素 ABA結(jié)合的 DC膜蛋白，在 34 ku附近有條帶，與預(yù)測分子量大小符合。見圖3。

圖2 Galectin-9蛋白的質(zhì)譜鑒定圖譜

2.3 qRT-PCR檢測DC Galectin-9 mRNA的表達(dá)

將 22例健康者與 16例 HT患者分離獲得等量DC，使用 TRIzol裂解后逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，實時熒光定量 PCR擴 增 Galectin-9和 β-actin基因，計 算 結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，健康組 Galectin-9 mRNA表達(dá)顯著高于 HT組，差異有統(tǒng) 計學(xué)意 義 （t=4.241，P＜ 0.01）。見圖4。

圖3 凝集素 ABA結(jié)合的 DC膜蛋白鑒定結(jié)果A：SDS-PAGE鑒定；B：Western blot鑒定；1：提取的 DC膜蛋白；2：凝集素 ABA結(jié)合蛋白后剩余上清液；3：Galβ1、4GalNAc競爭性洗脫下來的蛋白

圖4 DC Galectin-9 mRNA qRT-PCR結(jié)果與健康組比較：**P＜0.01

2.4 檢測DC Galectin-9表達(dá)Western blot顯影后，密度掃描結(jié)果顯示健康者 DC中 Galectin-9蛋白量高于HT患者；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示HT患者外周血 DC Galectin-9low比 例 高 于 健 康 者 （24.3%vs 7.5%，P＜0.01），見圖5、6。

圖5 W estern blot檢測 DC膜表面 Galectin-9蛋白表達(dá)

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 DC膜表面 Galectin-9蛋白表達(dá)

2.5 DC Galectin-9low對CD8+T細(xì)胞殺傷作用的影響DC與 CD8+T細(xì)胞混合，與 LPS共同孵育后ELISA法檢測細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示 HT患者來源的 DC Galectin-9low能 夠 顯著促進(jìn) CD8+T細(xì)胞分泌 IFN-γ、Perforin、Granzyme B（P＜0.01）。見圖7。

圖7 Galectin-9lowDC對 CD8+T細(xì)胞的殺傷功能影響A：IFN-γ；B：Perforin；C：Granzyme B；與 DC Galectin-9low比 較：**P＜0.01

3 討論

DC作為機體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，其表面存在眾多有免疫調(diào)節(jié)性的分子，了解這些 DC表面分子對其它免疫細(xì)胞功能的影響，進(jìn)而從 DC角度闡述該分子對 HT發(fā)生、發(fā)展的影響。基于此目的，首先要了解這些表面分子的表達(dá)變化，篩選出差異表達(dá)分子。因為這些分子多為糖基化蛋白，鑒于蛋白質(zhì)的種類眾多且仍存在許多未知的蛋白分子，本研究依據(jù)凝集素與糖的特異性識別，使用凝集素芯片法，對HT患者與健康者外周血中DC膜糖蛋白表達(dá)差異進(jìn)行比較。該方法具有較高的靈敏度，能夠?qū)ξ⑿〔町愡M(jìn)行檢測，且有芯片的高通量屬性。

凝集素芯片結(jié)果顯示 ABA特異性結(jié)合的糖蛋白在健康組顯著高于 HT組，因此對 sephadex-ABA結(jié)合的特異性糖蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)其中 Galectin-9含量最為豐富，同時 還存在 其它一 些糖蛋白。Galectin-9是半乳糖凝集素家族中的一員，有研究［14-15］報道其在自身免疫病中能夠通過 Tim-3下調(diào) Th1、Th17，同時能夠抑制 Treg細(xì)胞的功能。Galectin-9在 一 些 炎 癥 和自身免疫病動物 模 型 的 研究［15-16］中也呈現(xiàn)出了抗炎癥的功效。本研究的結(jié)果顯示，HT患 者 DC Galectin-9low比 例 較 高，推 測 其可能與HT的過度免疫有一定相關(guān)性。本研究通過HT與健康者外周血 DC與新生兒臍帶血 CD8+T細(xì)胞共同培養(yǎng)，以 LPS作為外刺激，隨后在 CD8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和殺傷毒素層面進(jìn)行了檢測。初步研究結(jié) 果 顯示，DC Galectin-9low能 夠刺激 CD8+T細(xì)胞分泌高水平的殺傷因子，提示 Galectin水平與免疫反應(yīng)自限性有關(guān)。而 DC細(xì)胞表面 Galectin在HT發(fā)病過程中發(fā)揮作用的機制及其表達(dá)的水平與HT患者的病情之間的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步探索，同時甲狀腺腺體內(nèi) DC在 HT是否也如此，仍亟需解答。

本研究首次運用凝集素芯片技術(shù)對 HT患者DC膜糖蛋白差異表達(dá)進(jìn)行了探索，篩選出 Galectin-9并驗證其在 HT患者與健康者外周血 DC表達(dá)水平的差異，為 HT體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng) DC免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的研究提供了線索。

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Analysis of glycoprotein in peripheral DC membrane from Hashimoto′s thyroiditis by lectin m icroarray

Yuan Yuan1，2，Tang Xiaolei3，Zhang Linjie1
（1Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230022；2Nuclear Medicine Dept，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004；3Clinical Laboratory，The Second People’s Hospital ofWuhu，Wuhu 241000）

Objective To analyze the differential expression of cytomembrane glycoprotein of peripheral blood DC between healthy donors and HT patients through lectin microarray and to study their functionin HT patients.Methods Cytomembrane glycoprotein of peripheral blood DC from 22 healthy donors and 16 HT patientswere extracted and then detected by lectin microarray.After that differential glycoproein-specific-binding lectin coupled sephadex were used to capture the glycoprotein which were then determined bymass spectrum.The expression of Galectin-9 and the proportion of Galectin-9lowDC were analyzed by qRT-PCR，Western blot and FCM respectively.At last，the secretion of IFN-γ，Perforin and Granzyme B in supernatants derived from DC co-culturewith CD8+T cellswere detected by ELISA.Resu lts The data of lectin microarray showed that the glycoprotein which specifically bound to lectin ABA was down-regualated in HT patients（P＜0.01）.All kinds of glycoprotein were identified by mass spectum，and the results showed that there was a great probability that the glycoprotein which specifically bound to lectin ABA was Galectin-9.Lower expression of Galectin-9 in DC from HT patients was observed，and there was ahigher proportion of Galectin-9lowDC in HT patients.There was higher production of IFN-γ，Perforin and Granzyme B in CD8+T cellswhich co-cultured with Galectin-9lowDC from HT patients.Conclusion This study suggests Galectin-9lowDC in peripheral blood associate with Hashimoto’s thyroiditis.

Hashimoto’s thyroiditis；dendritic cell；lectinmicroarray；Galectin-9

R 392.12

A

1000-1492（2016）02-0213-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.028.htm l

2015-11-17接收

安 徽 高 校 省 級 自 然 科 學(xué) 研 究 重 點 項 目 （編 號：KJ2011A167）

1安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230022

2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，蚌埠 2330043蕪湖市第二人民醫(yī)院檢驗科，蕪湖 241000

袁 媛，女，碩士研究生；

張林杰，男，教授，博 士生導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：zlj33＠vip.sina.com