C-8神經酰胺對肺泡Ⅱ型上皮細胞通透性及緊密連接蛋白的影響

汪 影，楊 進，劉 輝，畢繼蕊，衛園園，操基玉，陸友金

C-8神經酰胺對肺泡Ⅱ型上皮細胞通透性及緊密連接蛋白的影響

汪 影1，楊 進1，劉 輝1，畢繼蕊1，衛園園1，操基玉2，陸友金1

目的研究外源性 C-8神經酰胺對肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）單層通透性的影響，探討其作用機制。方法將體外分離培養的 AECⅡ通過差速貼壁法純化，在 Transwell上構建 單層，待細 胞融合后給 予不同 濃度的 C-8神經酰胺（0、25、50、100μmol／L）繼續培養 24 h，應用伏歐計測定跨上皮電阻值（TEER）及辣根過氧化物酶（HRP）標記法檢測吸光度（OD）值；分別提取細胞總蛋白及總 RNA，采用Western blot和實時定量聚合酶鏈式反應方 法檢測不同濃度的 C-8神經酰胺對 AECⅡ緊密連接蛋白 ZO-1和 Occludin蛋白水平和 mRNA水平表達的影響。結果不同濃度的 C-8神經酰胺刺激融合的 AECⅡ單層 24 h后，各組間 TEER值、OD值 差 異 均 有 統 計 學意 義 （F=38.780、19.780，P＜0.001）。C-8神 經 酰 胺 作 用 后，ZO-1、Occludin蛋 白 （F= 71.150，P＜0.01；F=7.703，P=0.002）及 mRNA（F= 4.887，P=0.014；F=3.637，P=0.048）表達量明顯降低。

神經酰胺；緊密連接；肺上皮細胞；跨上皮電阻

急性 呼 吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）最顯著的病理學變化是彌漫性肺泡上皮細胞損傷，包括肺泡上皮屏障、肺泡水清除、肺泡表面活性物質的分泌等［1］。其中肺泡上皮屏障損傷是 ARDS發病環節中的重要一步，而肺泡上皮屏障發揮選擇性通透作用主要依賴于肺泡上皮細胞間緊密連接［2］。研究［3］表明，神經酰胺在 ARDS肺水腫發展過程中發揮重要作用，其可抑制肺泡表面活性物質生成而促進肺水腫形成，然而目前有關神經酰胺與肺泡上皮屏障之間關系的研究甚少。研究［4］表明神經酰胺能夠增加腸道上皮細胞的通透性。該研究試圖在細胞水平上研究 C-8神經酰胺對肺上皮屏障通透性的影響，初步探討其作用機制，為下一步抑制神經酰胺生成從而治療ARDS提供理論依據，為 ARDS的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級 6～8周齡 ICR小鼠 8只，雌雄各半，20～25 g，由安徽省實驗動物中心提供。動物房溫度維持于 20～25℃，相對濕度（50± 5）%，每日光照時間約 12 h。將實驗鼠按雄：雌為 1∶1于 21∶00進行合籠，次日 9∶00查陰栓，陰栓陽性者記為妊娠第1天。

1.1.2試劑及器材 DMEM、胰酶、胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）、PBS均購自美國 Hyclone公司；C-8神經酰胺購自美國 Cayman公司；Transwell小室購自美國 Corning公司；跨上皮電阻儀購自美國 Millipore公司；ZO-1單克隆抗體購自美國 Zymed公司；Occludin多克隆抗體購自美國 Abcam公司；RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自美國 Promega公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養條件及方法 參照王勇 等［5］方法將第 17天 ICR孕鼠頸椎脫臼法處死，于酒精中浸泡5 min，取出胎鼠后置于預冷 4℃無菌 PBS中，提取雙肺并盡量除去氣管、支氣管、血管等組織，潤洗 3遍后用無菌眼科剪于 5 min之內剪成 1 mm3的小塊并用 PBS清洗直至液體清亮。0.25%胰蛋白酶消化組織塊 10 min，消化期間每隔 5 min震蕩 1次，隨即加入等體積的含有 10%FBS的 DMEM終止消化，過濾，1000 r／min（離心半徑為 156 mm）離心 5 min，棄上清液，加入含10%FBS的 DMEM制成細胞懸液接種于培養皿，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，1 h后換皿，重復 3次。24 h后換液，此時貼壁細胞即為肺泡 Ⅱ 型上皮 細胞（alveolar typeⅡ epithelial cells，AECⅡ）。

1.2.2胎鼠 AECⅡ的鑒定 ① 倒置相差顯微鏡觀察：運用倒置顯微鏡觀察 AECⅡ貼壁生長情況及形態學特征；② 堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）染色法鑒定：將對數生長期的 AECⅡ接種到12孔板制作細胞爬片，4%多聚甲醛固定，按照BCIP／NBT AKP顯色試劑盒說明書進行操作；③ 透射電鏡鑒定：對數生長期的 AECⅡ經 PBS清洗，胰酶消化后，2 500 r／min（離心半徑為 156 mm）離心10 min，2.5%戊二醛固定、包埋，制作超薄切片，于透射電鏡下觀察。

1.2.3肺上皮細胞單層通透性 ① 跨上皮電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）的 測 定：AECⅡ以 3×105／cm2接種于 Transwell的頂層小室微孔膜上，根據本課題組前期 MTT實驗結果［6］，隨機分為 0、25、50、100μmol／L C-8神經酰胺培養 24 h，應用跨上皮電阻測量儀檢測各組 TEER。② 辣根過氧化物酶標記法（horseradish peroxidase notation，HRP）：細胞融合后加入終濃度為 0、25、50、100 μmol／LC-8神經酰胺培養 24 h，棄去上室培養液，加入濃度為 0.34 mg／ml HRP的 DMEM，孵育 1 min后，取下室液 60μl，加入 860μl混合反應液（50 mmol／L NaH2PO4和 5 mmol／L愈創木酚）及 100μl新鮮配制的 0.6 mmol／L H2O2溶液，置于 12孔板中，室溫反應 15 min后檢測波長在 470 nm 下的HRP吸光度（optical density，OD）變化。

1.2.4Western blot法檢測緊密連接蛋白的表達給予不 同 濃 度 的 C-8神 經 酰 胺 （0、25、50、100 μmol／L）刺激后消化收集各組細胞，裂解離心（12 000 r／min，離心 10 min）提取蛋白質。二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，再轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉 90 min，TBST漂洗 10 min×3次；分別加入抗 ZO-1鼠單抗（1∶200）、抗 Occludin兔多抗（1∶250）4℃過夜，TBST漂洗 3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶100 000）于搖床室溫孵育 75 min，TBST漂洗 10 min×4次，ECL顯色。用天能圖像分析系統進行分析。

1.2.5實時定量 PCR檢測緊密連接 mRNA的表達

提取 RNA，逆轉錄為 cDNA，并以此為模板進行PCR擴 增。本 實 驗 所用 引 物 使用 PubMed在 線Primer3軟件設計，由上海生工公司合成，小鼠各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列和基因片段長度

1.3 統計學處理采用 SPSS 16.0統計軟件進行分析，正態性數據以 ˉx±s表示；兩組之間的均數比較采用兩獨立樣本 t檢驗，多組間的均數比較采用方差分析；兩兩比較采用 LSD檢驗。

2 結果

2.1 AECⅡ細胞鑒定倒置顯微鏡下觀察到原代培養18～24 h后，AECⅡ貼壁伸展，呈圓形或立方形，胞質內有大量細小顆粒圍繞細胞核分布（圖1A）；體外培養24 h后進行 AKP染色，細胞內 AKP反應產物呈深藍色（圖1B）；透射電鏡下可見 AECⅡ內有特征性的板層小體（箭頭所示），于細胞膜上有時可見微絨毛（圖1C）。

2.2 C-8神經酰胺對AECⅡ單層細胞通透性的影響隨著 C-8神經酰胺濃度的增加，TEER值逐漸下降，各組間 TEER值差異有統計學意義 （F= 38.780，P＜0.001）。不同濃度組與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HRP測定結果顯示，隨著濃度的增加 OD值呈上升趨勢，各組間 OD值差異有統計學意義（F=19.780，P＜0.001），神經酰胺 50μmol／L組和 100μmol／L組與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

圖1 AECⅡ細胞鑒定圖片A：倒置顯微鏡下可見 AECⅡ呈圓形或立方形 ×200；B：顯微鏡下可見細胞內的 AKP反應產物呈深藍色 AKP染色 ×200；C：電鏡下可見 AECⅡ內有特征性板層小體 ×15 000

表2 不同濃度 C-8神經酰胺對 AECⅡ單層通透性的影響（n=5，ˉx±s）

2.3 C-8神經酰胺對AECⅡ緊密連接蛋白表達的影響采用 Western blot法檢測各組 ZO-1和 Occludin蛋白的表達情況（圖2），結果顯示各組 ZO-1的表達差異有統計學意義（F=71.150，P＜0.001）。C-8神經酰胺各劑量組與對照組相比，ZO-1的表達均顯著下調（P＜0.05）。各組 Occludin的表達差異有統計學意義（F=7.703，P=0.002）。神經酰胺50μmol／L組和 100μmol／L組與對照組相比，Occludin的表達均下調（P＜0.05）。

圖2 C-8神經酰胺對 AECⅡ緊密連接蛋白表達的影響1：0μmol／L組；2：25μmol／L組；3：50μmol／L組；4：100μmol／L組；A：ZO-1；B：Occludin；與對照組（0μmol／L）比較：*P＜0.05

2.4 C-8神經酰胺對AECⅡ緊密連接mRNA表達的影響C-8神經酰胺作用后，ZO-1及 Occludin mRNA表達水平均有所下調（ZO-1：F=4.887，P= 0.014；Occludin：F=3.637，P=0.048），與對照組相比，C-8神經酰胺 100μmol／L組差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 C-8神經酰胺對 AECⅡ緊密連接 mRNA表達的影響A：ZO-1；B：Occludin；與對照組（0μmol／L）比較：*P＜0.05

3 討論

ARDS是臨床高病死率疾病，目前尚缺乏有效的診 斷 及 治 療 手 段［7］。 既 往 研 究［8-9］顯 示，在ARDS發生過程中，緊密連接蛋白表達和分布發生改變，對液體和蛋白質經細胞旁途徑選擇性通透作用增強而導致肺水腫。當機體遭受應激刺激時，神經酰胺可作為“第二信號分子”發揮信號傳導作用，放大炎癥反應引起組織損傷［10］。前期研究［6］已驗證神經酰胺可引起肺泡細胞損傷，本研究顯示在神經酰胺刺激下 TEER顯著下降，OD值呈上升趨勢，即神經酰胺導致肺泡上皮通透性增加，且這種變化具有一定的濃度依賴性。在哺乳動物體內，多種神經酰胺合酶可催化合成不同長度?；湹纳窠涻０?。研究［11］表明 C-8神經酰胺水溶性較好，細胞膜穿透力較強，對細胞的增殖分化具有更明顯的影響，故本實驗使用 C-8神經酰胺作為研究對象。

在 ARDS動物模型中神經酰胺增加［12］，通過抑制神經酰胺表達可以減輕肺水腫、炎癥反應，改善小鼠生存率［13］。同時神經酰胺參與腸上皮屏障及皮膚上皮屏障功能的調節［4］，本研究表明神經酰胺通過降低緊密連接蛋白的表達增加肺泡上皮細胞的通透性。本研究中4組間 AECⅡ各緊密連接表達量有明顯差異，Western blot顯示隨著神經酰胺劑量的增加，ZO-1及 Occludin表達逐漸減弱；應 用 Realtime PCR檢測到給予 100μmol／L神經酰胺刺激后AECⅡ表達 ZO-1、Occludin mRNA明顯降低。上述結果提示 C-8神經酰胺可能通過緊密連接影響肺上皮通透性，同時也可表明神經酰胺對緊密連接 ZO-1和 Occludin的調節主要發生在蛋白水平，加大劑量才發生轉錄水平的變化，這可能與神經酰胺導致的損傷是個急性損傷有關，具體機制仍有待研究。

綜上所述，本研究顯示 C-8神經酰胺能夠增加AECⅡ單層細胞的通透性，下調緊密連接蛋白的表達，這些蛋白可能是神經酰胺增加肺上皮屏障通透性的作用靶點，為進一步研究神經酰胺引起肺上皮屏障功能受損的分子機制提供了基礎，同時為 ALI提供新的診斷思路及治療靶點。

［1］劉晨風，吳小紅，曾 揚，等.白介素 33在百草枯誘導小鼠急性肺損 傷中 的作用 機 制研究 ［J］.安 徽 醫 科大學 學 報，2014，49（8）：1027-32.

［2］Koval M.Claudin heterogeneity and control of lung tight junctions［J］.Annu Rev Physiol，2013，75：551-67.

［3］Sparkman L，Chandru H，Boggaram V.Ceramide decreases surfactant protein B gene expression via downregulation of TTF-1 DNA binding activity［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290（2）：L351-8.

［4］Janssens M，van Smeden J，Gooris G S，et al.Increase in shortchain ceramides correlates with an altered lipid organization and decreased barrier function in atopic eczema patients［J］.J Lipid Res，2012，53（12）：2755-66.

［5］王 勇，操基玉，郭冬梅，等.油煙中細顆粒物致胎鼠肺泡Ⅱ 型上皮細胞氧化應激指標的影響［J］.環境與健康雜志，2010，27（10）：872-5.

［6］衛園園，楊 進，陸友金，等.神經酰胺對胎鼠肺泡 Ⅱ 型上皮細胞增殖的影響［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（10）：1502-5.

［7］吳學玲，白春學.新型甲型 H1N1流感誘發急性肺損傷的診治進展［J］.中華結核和呼吸雜志，2010，33（6）：448-51.

［8］Xie W，Wang H，Wang L，et al.Resolvin D1 reduces deterioration of tight junction proteins by upregulating HO-1 in LPS-induced mice［J］.Lab Invest，2013，93（9）：991-1000.

［9］Uchida T.Acute lung injury and alveolar epithelial function［J］.J Anesth，2011，25（1）：152-4.

［10］Tibboel J，Reiss I，de Jongste JC，et al.Sphingolipids in lung growth and repair［J］.Chest，2014，145（1）：120-8.

［11］Karasavvas N，Erukulla R K，Bittman R，etal.Stereospecific induction of apoptosis in U937 cells by N-octanoyl-sphingosine stereoisomers and N-octyl-sphingosine.The ceramide amide group isnot required for apoptosis［J］.Eur JBiochem，1996，236（2）：729-37.

［12］von Bismarck P，Wist?dtC F，Klemm K，etal.Improved pulmonary function by acid sphingomyelinase inhibition in a newborn piglet lavagemodel［J］.Am JRespir Crit Care Med，2008，177（11）：1233-41.

［13］Yang J，Qu JM，Summah H，et al.Protective effects of imipramine in murine endotoxin-induced acute lung injury［J］.Eur J Pharmacol，2010，638（1-3）：128-33.

Effects of C-8 ceram ide on themonolayer permeability and the tight junction proteins in alveolar epithelial typeⅡ cells

Wang Ying，Yang Jin，Liu Hui，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To study the impactof C-8 ceramide on the alveolar epithelial barrier and the tight junction proteins of alveolar epithelial typeⅡ cells（AECⅡ）.Methods The primarily cultured AECⅡ was purified by differential adherencemethod.The cellswere seeded on Transwell polyestermembranes to construct in vitro models of AECⅡ monolayerswith different concentrations of C-8 ceramide（0，25，50，100μmol／L）for24 hourswhen they became fused.Themonolayer permeability wasmeasured by transepithelial electrical resistance（TEER）and horseradish peroxidase notation（HRP）.The total protein and RNA were extracted from AECⅡ.Western blot and real-time quantitative pclymerase chain reaction were used to detect the protein and mRNA levelsof ZO-1，Occludinrespectively.Results Stimulated with different concentration of C-8 ceramide for 24 h，the TEER of cells decreased（F=38.78，P＜0.001）and the OD470increased（F=19.78，P＜0.001）significantly.Results from Western blot and RT-PCR demonstrated significant decrease of ZO-1（F=71.150，P＜0.01；F=4.887，P= 0.014）and Occludin（F=7.703，P=0.002；F=3.637，P=0.048）expression in the AEC Ⅱ with C-8ceramide.Conclusion C-8 ceramidemay disrupt the alveolar epithelial barrier by decreasing expression of ZO-1 and Occludin.

ceramides；tight junction；pulmonary epithelial cell；trans-epithelial electrical resistance

R 563

A

1000-1492（2016）02-0195-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.020.htm l

2015-11-23接收

國家自然科學基金（編號：81400058）；安徽省自然科學基金項目（編號：1208085QH165）

1安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，合肥 2306012安徽醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系，合肥 230032

汪 影，女，碩士研究生；陸友金，男，副教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：luyougolden＠hotmail.com

結論C-8神經酰胺可能通過下調緊密連接蛋白的表達增加肺泡Ⅱ型上皮細胞通透性。