靶向 PDGF受體-α的 RNA干擾對 RPE細胞增殖和凋亡的影響

秦賢杰，彭燕一，秦 程

靶向 PDGF受體-α的 RNA干擾對 RPE細胞增殖和凋亡的影響

秦賢杰，彭燕一，秦 程

目的探討針對血小板源性生長因子受體-α（PDGFR-α）的 RNA干 擾 對 體 外 培 養(yǎng) 的 人 視 網(wǎng) 膜 色 素 上 皮（hRPE）細胞增殖和凋亡的影響，為臨床治療增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）提供實驗依據(jù)。方法利用脂質(zhì)體將合成的 shRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 hRPE細胞，MTT法檢測 hRPE細胞增殖活性；RT-PCR法檢測細胞中 PDGFR-αmRNA的表達；Western blot法 檢 測 PDGFR-α蛋 白 表 達 水 平；Hoechst 33258熒光染料核染分析細胞凋亡；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率。結(jié)果PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 24～72 h后，細胞增 殖 明 顯 受 到 抑 制，呈 時 間 劑 量 效 應(yīng) （P＜0.05）；PDGFR-αshRNA作 用 hRPE細 胞 48 h后，實 驗 組PDGFR-α基因 mRNA和蛋白的表達水平較空白對照組及陰性對照組明顯降低（P＜0.05）；實驗組細胞的凋亡率分別為（37.10±0.55）%、（50.8±1.41）%，與空白對照組（11.7± 1.11）%及陰性對照組（13.5±1.05）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組 G1期細胞百分比分別為（64.76± 1.16）%、（75.64±0.93）%，與 空 白 對 照 組 （54.51± 1.40）%及陰性對照組（56.04±2.19）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論PDGFR-αshRNA能抑制 hRPE細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

血小板源性生長因子受體-α；RNA干擾；視網(wǎng)膜色素上皮細胞；增殖；凋亡

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜 病 變 （proliferative vitreoretinopathy，PVR）是指增生的纖維膜對視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層前后面的收縮、牽拉所導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離、失明的一種疾病，視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE）細胞在纖維膜的形成、收縮過程中起著重要的作用［1］。血 小板 源 性 生 長 因 子 （platelet derived growth factor，PDGF）是機體內(nèi)一種重要的促使細胞生長、分化的生長因子。研究［2］表明，PDGF對誘發(fā) RPE細胞的增殖、移行，最終導(dǎo)致 PVR的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。玻璃體內(nèi)許多非 PDGF家族的因子均可激活 PDGF受體（PDGFR），采用中和 PDGF的方法來治療 PVR所取得的效果并不理想。因此，阻斷 PDGFR通路是預(yù)防 PVR發(fā)生的基本路徑；PDGFR由亞單位 α和 β構(gòu)成，而 PDGFR-α與 PVR的產(chǎn)生有著更強的相關(guān)性［3］。該實驗通過將 PDGFR-α shRNA 轉(zhuǎn) 染 至 hRPE細 胞 內(nèi)，研 究PDGFR-αshRNA對 hRPE細胞增殖、凋亡的影響，為 PVR的臨床防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人視網(wǎng)膜色素上皮（human retinal pigment epithelium，hRPE）細胞（中山大學(xué)細胞庫）；澳洲胎牛血清、低糖型 DMEM 培養(yǎng)基（美國 Gibco公司）；脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒 （北京天根生化科技有限公司）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；兔抗人 PDGFR-α多克隆抗體（美國圣克魯斯生物技術(shù)公司）；辣根酶標記山羊抗兔 lgG親合 純化（北 京中杉金橋 生 物 技術(shù)有限 公司）。本實驗所用質(zhì)粒由武漢賽晶技術(shù)有限公司提供，其 正 義 鏈：5′-CTACTACTGTTATCAGTAATG-3′，反義鏈：5′-CATTACTGATAACAGTAGTAG-3′。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng) hRPE細胞采用含 10%胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2～3 d用 0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染與試驗分組 0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，用不含抗素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞 24 h后，細胞融合率達 60% ～70%時轉(zhuǎn)染，操作嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑說明進行，轉(zhuǎn)染 6 h后換成無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。通過預(yù)實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件得出：PDGFR-αshRNA質(zhì)粒表達載體與脂質(zhì)體的比例為1μg∶2.5μl時為最佳轉(zhuǎn)染比例，PDGFR-αshRNA作用細胞的最佳濃度為 2.0μg／m l。試驗分組：空白對照組（不含 shRNA和脂質(zhì)體）、與靶細胞基因無同源性的陰性對照組（含 NC-shRNA和脂質(zhì)體）、1.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 1.0μg／m l shRNA和脂質(zhì)體）、2.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 2.0μg／ml shRNA和脂質(zhì)體）。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖活性 hRPE細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，以 5×103個／孔的密度接種于 96孔板，每組 6孔；在 37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng) 24 h，細胞融合度達 60% ～70%時進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)分別培養(yǎng) 24、48、72 h，每孔加 5 g／L MTT溶液各20μl，放入培養(yǎng)箱中作用 4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入 DMSO 150μl，搖床上輕搖 10 min后用酶標儀進行測試，在 490 nm波長處檢測吸光度（absorbance，A）值，計算細胞生長抑制率。

1.2.4RT-PCR法檢測 PDGFR-αmRNA的表達將對數(shù)生長期的細胞以 5×105個／孔的密度接種于6孔板，24 h后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，采用 TRIzol法提取相應(yīng)各組的總 RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得 cDNA用作 PCR反應(yīng)模板。PDGFR-αF：5′-GCTCAAAATGAAGATGCTGTG-3′，R：5′-CCTCCACGGTACTCCTGTCT-3′，擴 增 產(chǎn) 物長度為 270 bp，PCR反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5 min；94℃，30 s，52℃，30 s；72℃，1 min，共 35個循環(huán)，72℃延伸 5min；產(chǎn)物經(jīng) 15 g／L瓊脂糖電泳檢測，拍照，結(jié)果用圖像處理儀分析處理，測定目的基因及內(nèi)參的灰度值。

1.2.5Western blot檢測細胞中 PDGFR-α蛋白的表達 取轉(zhuǎn)染48 h的 hRPE細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細胞裂解液刮取細胞，并超聲裂解，蛋白定量，10%SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉；加入一抗，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫搖床孵育 2 h，ECL發(fā)光、曝片。

1.2.6Hoechst33258熒光核染分析細胞凋亡 采用胰酶消化 hRPE細胞，以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，24 h后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用 Hoechst33258熒光染料染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察、分析。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，至60% ～70%融合時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，使細胞周期同步化，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化、2 000 r／min離心 5 min并收集細胞，以預(yù)冷的 70%乙醇固定，4℃過夜，2 000 r／min離心 5 min后洗滌以PI染液重懸，用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。本實驗測量的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢驗呈正態(tài)分布，計量資料以 ˉx±s表示；多組間的均數(shù)比較采用方差分析和 SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組hRPE細胞的形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)染 48 h后，空白對照組和陰性對照組細胞均生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，貼壁好，細胞數(shù)目多；1.0 μg／ml shRNA組細胞數(shù)量減少、間隙增大，出現(xiàn)脫壁、皺縮，甚至碎裂現(xiàn)象。與 1.0μg／m l shRNA組相比，2.0μg／ml shRNA組細胞數(shù)量明顯減少，死亡、漂浮、碎裂細胞明顯增多。見圖1。

2.2 PDGFR-αshRNA對hRPE細胞增殖的影響

圖1 倒置顯微鏡下各組 hRPE細胞的生長狀態(tài) ×200A：空白對照組；B：陰性對照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

PDGFR-αshRNA分別作用于 hRPE細胞 24、48、 72 h，hRPE細胞的增殖均受到抑制，隨時間和劑量的增加而呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 238.95、224.38、1 228.75，P＜0.05）。見表 1。

表1 轉(zhuǎn)染 PDGFR-αshRNA后對 hRPE細胞生長抑制率的影響（n=3，ˉx±s）

2.3 hRPE細胞中PDGFR-αmRNA和蛋白的表達變化PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 48 h后，PDGFR-αmRNA和蛋白在 RPE細胞中的表達隨shRNA作用濃度的增強呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=74.20、125.94，P＜0.05）。見 圖2、3，表2。

圖2 PDGFR-αmRNA表達

圖3 PDGFR-α蛋白表達1：空白對照組；2：陰性對照組；3：1.0μg／ml shRNA組；4：2.0 μg／ml shRNA組

表2 細胞內(nèi) PDGFR-α蛋白和 mRNA的表達（n=3，ˉx±s）

2.4 hRPE細胞凋亡的變化PDGFR-αshRNA處理 hRPE細胞 48 h，Hoechst33258染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞核處出現(xiàn)致密濃染顆粒狀或團塊狀熒光的凋亡細胞隨用藥濃度的升高而增加，空白對照組及陰性對照組則出現(xiàn)較少。見圖4。

圖4 Hoechst33258染色觀察細胞凋亡 ×400A：空白對照組；B：陰性對照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

2.5 PDGFR-αshRNA對細胞周期及凋亡的影響

PDGFR-αshRNA作用 hRPE細胞 48 h后，細胞周期各時相比例及總體凋亡率發(fā)生了顯著的變化，G1期細胞比例及凋亡率顯著增加，呈劑量效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=125.49、927.55，P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度的 PDGFR-αshRNA對 hRPE細胞周期和凋亡率的影響（n=3，ˉx±s）

3 討論

PDGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的促有絲分裂生長因子，其可由多種細胞產(chǎn)生并分泌，可刺激特定細胞群的分裂與增殖。研究［4］證實，PDGF是 PVR形成過程中最重要的生長因子之一，PDGF能夠刺激 RPE細胞增生和遷移，還可以促進 RPE細胞表達 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），α-SMA的表達又可刺激 RPE細胞的轉(zhuǎn)型，對 PVR的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用［5］。

PVR的發(fā)生發(fā)展是多種細胞、體液因素之間相互作用的結(jié)果，RPE細胞不但是增殖膜形成和收縮的主要細胞，而且還可以產(chǎn)生趨化因子，吸引膠質(zhì)細胞和成纖維細胞等參與增殖膜的形成［6］。Cassidy etal［7］發(fā)現(xiàn)，與單純患有 DR的患者比較，伴有 PVR患者 的 成 纖 維 生 長 因 子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和 PDGF水平均升高。梁勇 等［8］采用免疫電鏡雙標記法證實了 PVR增殖膜中 RPE細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞是 PDGF的分泌細胞。RPE細胞可分泌PDGF，同時又含有 PDGF受體，在增生膜中 PDGF的自分泌及旁分泌作用機制對 PVR的發(fā)展起到重要作用［9］，因此，通過阻斷 PDGF受體通路來抑制RPE細胞的增殖對防治 PVR有著重要的意義。李林林 等［10］發(fā)現(xiàn)，抗 PDGFR-α抗體可以抑制鐵銹誘導(dǎo)的 hRPE細胞的增殖活性。在基因治療領(lǐng)域，有學(xué)者［11］利用反義寡核苷酸技術(shù)沉默 PDGFR-α的基因表達，發(fā)現(xiàn) PDGFR-αASODN可以顯著抑制 RPE細胞的增生，并能誘導(dǎo)其凋亡。蔣姣姣 等［12］通過動物實驗證實了 PDGFR-αASODN可以降低 PVR的發(fā)展程度，推測其可能與下調(diào)視網(wǎng)膜細胞中 PDGFR-α有關(guān)。

RNA干擾是近幾年發(fā)展起來的新興的基因阻斷技術(shù)，因其高特異性、高效性、低毒等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用 于 多 種 疾 病 的 治 療。 研 究［13］表 明 靶 向PDGF-A mRNA的 shRNA可以有效抑制 RPE細胞的增殖和移行，并能夠抑制 PVR的發(fā)生、發(fā)展。本研究首次將 PDGFR-αshRNA轉(zhuǎn)染至 hRPE，RT-PCR和 Westem blot檢測結(jié)果顯示 PDGFR-αshRNA能有效沉默 hRPE細胞中靶基因的表達，并且呈劑量效應(yīng)。MTT檢測顯示細胞生長受到抑制，呈時間濃度依賴性，可能與本實驗沉默了 hRPE細胞中 PDGFR-α基因的表達，使靶細胞膜上相應(yīng)的受體生成減少，阻斷了 PDGF的生物學(xué)作用，導(dǎo)致細胞增殖活性降低有關(guān)。本實驗應(yīng)用 PDGFR-αshRNA沉默人 RPE細胞后，細胞周期發(fā)生了改變，S期、G2／M期比例顯著降低，G1期的比列顯著增加，細胞周期表現(xiàn)出 G1期阻滯，說明 PDGFR-αshRNA可將細胞阻滯于 G1期。G1期為細胞的 DNA合成前期，細胞阻滯于 G1期，其增殖受到抑制。本研究流式細胞儀及熒光核染結(jié)果觀察到，細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，推測其凋亡機制可能為沉默 PDGFR-α基因表達阻斷了一系列細胞信號的激活，啟動了細胞的凋亡程序從而誘導(dǎo)了細胞的凋亡。

綜上所述，PDGFR-αshRNA轉(zhuǎn)染于 hRPE細胞后，可以有效的抑制 RPE細胞的增殖，促進細胞凋亡并將 RPE細胞阻滯于 G1期，為進一步應(yīng)用 shRNA防治 PVR提供了實驗依據(jù)，PDGFR-αshRNA作用細胞的具體調(diào)控機制還有待于進一步深入的研究和探討。

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Effects of RNA interference targeting PDGF receptor-αon RPE cells proliferation and apoptosis

Qin Xianjie，Peng Yanyi，Qin Cheng
（Dept of Ophthalmology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000）

Objective To investigate the effect of RNA interference targeting platelet-derived growth factor receptor-α（PDGFR-α）on hRPE cell proliferation and apoptosis in vitro，so thatexperimental evidence was provided for the clinical treatmentof proliferative vitreoretinopathy.Methods Retinal pigmentepithelium cellswere cultured in vitro，and shRNA which was chemically synthesized was transfected into hRPE cellmediated by cationic liposomes，the cell proliferation ability was detected by MTT；the expression of PDGFR-αmRNA of hRPE cells was detected by Reverse Transcription Polymerase Chain Response；the expression of PDGFR-αprotein was detected by Western blot；cell apoptosiswas analyzed by Hochest33258；the Flow Cytometrywas used to analyze the effectof cycle and apoptosis.Results PDGFR-αshRNA had effect on hRPE cells24～72 h，the proliferation of hRPE cellswere inhibited，and showed a time-dose response（P＜0.05）；after treated with PDGFR-αshRNA 48 h，the expression of mRNA and protein of PDGFR-αgene was significantly reduced compared with the control group and negative control group（P＜0.05）；the apoptosis rate of experimental group was（37.10±0.55）%，（50.8±1.41）%，compared with the blank control group（11.7±1.11）%and the negative control group（13.5±1.05）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）；the percentage of G1 phase of experimental group was（64.76± 1.16）%，（75.64±0.93）%，compared with the blank control group（54.51±1.40）%and the negative control group（56.04±2.19）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion PDGFR-αshRNA can inhibit hRPE cells proliferation and induce apoptosis.

PDGF-αreceptor；RNA interference；retinal pigment epithelial cells；proliferation；apoptosis

R 774.1

A

1000-1492（2016）02-0180-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.014.htm l

2015-11-06接收

廣西自然科學(xué)基金項目（編號：KY2012021）；廣西科學(xué)實

驗中心開放課題項目（編號：KFJJ2011-11）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，桂林 541000

秦賢杰，男，碩士研究生；

彭燕一，女，主 任 醫(yī) 師，碩 士 生 導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：yypeng-7＠hotmail.com