氨氯地平和纈沙坦對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞 NADPH氧 化 酶 亞 基 gp91phox和 p22phox表 達 的 影 響

盧挪挪，韓衛(wèi)星，劉 超，王 成，吳繼軍

氨氯地平和纈沙坦對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞 NADPH氧 化 酶 亞 基 gp91phox和 p22phox表 達 的 影 響

盧挪挪1，韓衛(wèi)星1，劉 超2，王 成3，吳繼軍1

目的研究不同濃度的氨氯地平和纈沙坦對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亞基 gp91phox和 p22phox的影響。方法對照組：體外貼壁培養(yǎng) HCAEC，不進行其他干預(yù)；實驗組：相同培養(yǎng)條件下分別加入不同濃度氨氯地平（1×10-5、1×10-6、1 ×10-7、1×10-8、1×10-9mol／L）和不同濃度纈沙坦（1× 10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol／L）體外培養(yǎng)24 h。提取各組細(xì)胞的膜 蛋白，應(yīng)用 Western blot法測兩組細(xì)胞中 p22phox和 gp91phox的 表 達水平，對結(jié)果 進 行 統(tǒng)計分析并比較。結(jié)果不同濃度氨氯地平對 HCAEC內(nèi) NADPH氧化酶亞基 p22phox表達均有促進作用（P＜0.05），高濃度氨氯地平 對 gp91phox有 抑 制 作 用 （P＜0.05），低 濃 度 則 會 促 進gp91phox的 表 達 （P＜0.05）。 不 同 濃 度 纈 沙 坦 對 p22phox與gp91phox的表達均有顯著的抑制作用（P＜0.05），且有隨著藥物濃度增高抑制作用增強的趨勢（P＜0.05）。結(jié)論纈沙坦有抑制氧化應(yīng)激的效力，并隨濃度增高而增強，呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢；氨氯地平僅在高濃度時抑制部分 NADPH氧化酶亞基（gp91phox）的 表達，低濃度時 反而可能增 加 氧化應(yīng)激水平。

氨氯地平；纈沙坦；人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；p22phox；gp91phox

氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和 活 性 氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是內(nèi)皮細(xì)胞中 ROS主要來源［1］。NADPH 氧 化 酶 由 gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox、p40phox和 Rac等 6 種 亞 基 構(gòu) 成。 其 中 gp91phox和 p22phox位于細(xì)胞質(zhì) 膜上，當(dāng) 與胞漿 中的另外幾種亞基結(jié)合時可形成有活性的 NADPH氧化酶復(fù)合體［2］。gp91phox與 p22phox是 NADPH氧化酶的主要功能亞基［3］。內(nèi)皮細(xì)胞靜息狀態(tài)時，通過 NADPH氧化酶產(chǎn)生適量活性氧滿足正常的代謝需求，但在高血壓、高脂血癥和冠心病等心血管高風(fēng)險因素存在情況下，NADPH氧化酶活性明顯提高［4-5］。氨氯地平和纈沙坦是治療心血管疾病的常用藥，被報道具有抗氧化應(yīng)激作用。但是此兩種藥物降低氧化應(yīng)激水平的具體途徑與機制尚不明確。該研究旨在探討氨氯地平和纈沙坦對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）內(nèi) NADPH氧化酶亞基 gp91phox和 p22phox的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 HCAEC購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國 Hyclone公司；小鼠抗人單克隆抗體p22phox（ab80896）、兔 抗 人 多 克 隆 抗 體 gp91phox（ab31092）購自英國 Abcam公司；小鼠抗人單克隆抗體 β-actin、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司；氨氯地平和纈沙坦購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國 Pierce公司；蛋白 Marker購自北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1HCAEC復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代 將水浴箱預(yù)熱至37℃，做好細(xì)胞復(fù)蘇前準(zhǔn)備。從液氮中取出凍存的 HCAEC，快速放入水浴箱中，不停搖晃，使其迅速溶解。在超凈臺中，把溶解的細(xì)胞移入 10 ml離心管，加 DMEM完全培養(yǎng)液 4 ml（90%DMEM+10% FBS+青霉素 100 U／ml+鏈霉素 100 U／m l），1 000 r／min離心 5 min，吸去上清液，再次加入完全培養(yǎng)液 4 ml，輕輕吹打、重懸細(xì)胞，待細(xì)胞懸液分布均勻后吸取適當(dāng)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底面約90%，棄上清液，無菌 PBS洗 2次，加胰酶2m l，放入培養(yǎng)箱消化約 30 s后取出，吸去胰酶，加入完全培養(yǎng)液4 ml輕輕吹打，直到貼壁細(xì)胞完全脫落，吸取細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入 10 ml離心管，步驟同上。以一定密度傳代。

1.2.2HCAEC培養(yǎng)及藥物處理 將 HCAEC以 1 ×105個／m l的密度接種到 12個直徑為 100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)皿面積的 80%，吸去培養(yǎng)液，隨機將細(xì)胞分為兩組。氨氯地平組：根據(jù)所含藥物濃度分為對照組、1×10-5mol／L、1×10-6mol／L、1×10-7mol／L、1×10-8mol／L、1×10-9mol／L 6組；纈沙坦組：根據(jù)所含藥物濃度分為對照組、1 ×10-4mol／L、1×10-5mol／L、1×10-6mol／L、1× 10-7mol／L、1×10-8mol／L 6組。分別在不同培養(yǎng)皿中加入含相應(yīng)藥物濃度的 1%FBS完全培養(yǎng)基，對照組加入與實驗組相同體積不含藥物的 1%FBS完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24 h后，收取細(xì)胞備用。

1.2.3Western blot法 測 定 細(xì) 胞 膜 中 p22phox和gp91phox水平 根據(jù)膜蛋白提取試劑盒使用說明提取膜蛋白，以 Bradford法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃水浴 5 min，置于冰上待用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，5%濃縮膠以120 V電壓電泳，15%分離膠以 150 V電壓電泳，待所需目的條帶相應(yīng)位置分開。后取出凝膠，以 300 mA恒流低溫轉(zhuǎn)膜 1.5 h，取出 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，后加入相應(yīng)抗體，一抗于 4℃孵育過夜，TBST洗膜 5次，每次 5 min，二抗室溫孵育 2 h，再以TBST洗膜 5次，每次 5 min，壓片曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用統(tǒng)計軟件 SPSS 13.0進行分析，數(shù)據(jù)用 ˉx±s表示；多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用 SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果目的條帶應(yīng)用軟件 photoshop進行灰度計算。

2 結(jié)果

2.1 氨氯地平對HCAEC膜蛋白p22phox表達的影響各濃度組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），隨著氨氯地平濃度的降低 p22phox表達顯示升高的趨勢（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同氨氯地平濃度對 HCAEC膜蛋白 P22phox表達的影響1：對照組；2：氨氯地平（1×10-5mol／L）組；3：氨氯地平（1× 10-6mol／L）組；4：氨氯地平（1×10-7mol／L）組；5：氨氯地平（1× 10-8mol／L）組；6：氨氯地平（1×10-9mol／L）組；與對照組比較：*P＜0.05；與氨氯地平（1×10-5mol／L）組比較：＃P＜0.05；與氨氯地平（1×10-6mol／L）組比 較：△P＜0.05；與 氨氯地平（1×10-7mol／L）組比較：▽P＜0.05；與氨氯地平（1×10-8mol／L）組比較：○P＜0.05

2.2 氨氯地平對HCAEC膜蛋白gp91phox表達的影響在 1×10-9～1×10-8mol／L范圍內(nèi) gp91phox的表達量呈現(xiàn)升高趨勢，與對照組以及兩濃度組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在（1×10-7～1×10-5mol／L）濃度范圍內(nèi) gp91phox表達量呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05），但只有在氨氯地平濃度達到1× 10-5mol／L時與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同氨氯地平濃度對 HCAEC膜蛋白 gp91phox表達的影響1：對照組；2：氨氯地平（1×10-9mol／L）組；3：氨氯地平（1× 10-8mol／L）組；4：氨氯地平（1×10-7mol／L）組；5：氨氯地平（1× 10-6mol／L）組；6：氨氯地平（1×10-5mol／L）組；與對照組比較：*P＜0.05；與氨氯地平（1×10-9mol／L）組比較：＃P＜0.05；與氨氯地平（1×10-8mol／L）組比較：△P＜0.05；與氨氯地平（1×10-7mol／L）組比較：▽P＜0.05；與氨氯地平（1×10-6mol／L）組比較：○P＜0.05

2.3 不同纈沙坦?jié)舛葘CAEC膜蛋白p22phox表達的影響不同纈沙坦?jié)舛?p22phox的表達量與對照組比較均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各濃度組之間變化不明顯。見圖3。

圖3 不同纈沙坦?jié)舛葘?HCAEC膜蛋白 p22phox表達的影響1：對照組；2：纈沙坦（1×10-4mol／L）組；3：纈沙坦（1×10-5mol／L）組；4：纈沙坦（1×10-6mol／L）組；5：纈沙坦（1×10-7mol／L）組；6：纈沙坦（1×10-8mol／L）組；與對照組比較：*P＜0.05；與纈沙坦（1×10-4mol／L）組比較：＃P＜0.05；與纈沙坦（1×10-5mol／L）組比較：△P＜0.05

2.4 不同纈沙坦?jié)舛葘CAEC膜蛋白gp91phox表達的影響隨著纈沙坦?jié)舛鹊脑黾樱琯p91phox表達量呈現(xiàn)下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同纈沙坦?jié)舛葘?HCAEC膜蛋白 gp91phox表達的影響1：對照組；2：纈沙坦（1×10-8mol／L）組；3：纈沙坦（1×10-7mol／L）組；4：纈沙坦（1×10-6mol／L）組；5：纈沙坦（1×10-5mol／L）組；6：纈沙坦（1×10-4mol／L）組；與對照組比較：*P＜0.05；與纈沙坦（1×10-8mol／L）組比較：＃P＜0.05；與纈沙坦（1×10-7mol／L）組比較：△P＜0.05；與纈沙坦（1×10-6mol／L）組比較：▽P＜0.05

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，完成血液和組織液的物質(zhì)交換，合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，保證血管正常的收縮和舒張，起到維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓以及凝血與抗凝平衡等功能，進而保持血液的正常流動和血管的長期通暢。動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可能是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)病的始動或促進因素，在動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭等心血管疾病中都涉及到內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和凋亡。冠狀動脈斑塊的形成以及破裂與 ROS的氧化性損傷有關(guān)，其作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，引起多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生及活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡以及血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生遷移，最終引起冠狀動脈內(nèi)斑塊的形成以及破裂［6］。氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是心血管疾病中內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要機制，而 NADPH氧化酶是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 ROS的主要來源。本研究選取目的蛋白 gp91phox和 p22phox是 NADPH氧化酶的兩個重要亞基，對反映內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平有一定代表性。氨氯地平和纈沙坦是臨床上常用的降血壓藥物，兩種藥物的臨床降壓療效已得到肯定。國內(nèi)外很多臨床和基礎(chǔ)研究都提示氨氯地平和纈沙坦有抗動脈粥樣硬化的作用，氨氯地平是一類長效鈣通道阻滯劑，是由左、右旋對映異構(gòu)體等比組成的外消旋體化合物，CAMELOT和 PREVENT研究均顯示氨氯地平可以延緩冠狀動脈粥樣硬化的進展［7-8］。對高血脂兔的研究［9］顯示氨氯地平能夠降低心臟和血液中氧化應(yīng)激和改善血脂水平。對卒中型自發(fā)性高血壓大鼠的研究［10］表明氨氯地平通過恢復(fù) Cu／ZnSOD活性起到抗動脈硬化作用。對自發(fā)性大鼠的腎皮質(zhì)的研究［11］表明氨氯地平對 NADPH氧化酶亞基的表達無影響。纈沙坦是特異性的血管緊張素Ⅱ（AT1）受體拮抗劑，ARB類藥物可以降低氧化應(yīng)激水平［12］。臨床中運用 ARB類與他汀類藥物聯(lián)合用藥治療心血管系統(tǒng)疾病，可以更好的降低組織的氧化應(yīng)激水平，比兩者單獨使用更加有效［13］。研究［14］顯示厄貝沙坦和氨氯地平的臨床劑量聯(lián)合治療能顯著防止冠狀動脈粥樣硬化病變的形成和 AMI的發(fā)病率，改善了小鼠的預(yù)后。研究［15］表明纈沙坦能有效抵消高血壓相關(guān)的血脂異常和氧化應(yīng)激，并可逆轉(zhuǎn)所有與高血壓有關(guān)的脂質(zhì)變化和氧化還原變化，尤其是在高血壓伴有高甘油三酯血癥和嚴(yán)重氧化應(yīng)激狀態(tài)的患者。因此，纈沙坦作為臨床常用的 ARB類藥物有降低氧化應(yīng)激的作用。

本研究是系列研究課題中的初步試驗，旨在了解不同濃度的纈沙坦和氨氯地平對氧化應(yīng)激的影響，結(jié)果表明纈沙坦可以顯著降低 NADPH氧化酶gp91phox和 p22phox亞基的表達，在一定 濃度范 圍內(nèi)隨著纈沙坦?jié)舛鹊脑龈呖寡趸瘧?yīng)激能力增強，呈濃度依賴性，提示纈沙坦有抗氧化應(yīng)激的作用。本試驗結(jié)果還顯示氨氯地平僅在高濃度時對 gp91phox有抑制作用，而對 p22phox亞基無抑制作用，低濃度時對gp91phox和 p22phox亞基均有促 進增加 的作用，表明氨氯地平抗氧化應(yīng)激作用不強，且與濃度有關(guān)，適當(dāng)?shù)臐舛炔拍軐Σ糠?NADPH亞基（gp91phox）有抑制作用，低濃度的氨氯地平可能會促進氧化應(yīng)激的發(fā)生。由此試驗結(jié)果也可以解釋既往報道的氨氯地平有抗氧化應(yīng)激作用和無抗氧化應(yīng)激作用的矛盾結(jié)果，可能與不同研究的設(shè)計、目的指標(biāo)和藥物濃度有關(guān)。

本研究局限于實驗室基礎(chǔ)研究，細(xì)胞的體外培養(yǎng)不能完全反應(yīng)正常機體的情況，而且，缺少對NADPH氧化酶其他亞基的研究。因此，尚需進行進一步研究驗證，并探討纈沙坦抗氧化應(yīng)激的可能機制。

［1］Deng B，Xie S，Wang J，et al.Inhibition of protein kinase Cβ（2）prevents tumor necrosis factor-α-induced apoptosisand oxidative stress in endothelial cells：the roleof NADPH oxidase subunits［J］.JVasc Res，2012，49（2）：144-59.

［2］Gardiner G J，Deffit SN，McLetchie S，et al.A role for NADPH oxidase in antigen presentation［J］.Front Immunol，2013，4：295.

［3］Selemidis S，Sobey C G，W ingler K，et al.NADPH oxidases in the vasculature：molecular features，roles in disease and pharmacological inhibition［J］.Pharmacol Ther，2008，120（3）：254-91.

［4］Souza H P，Laurindo FR，Ziegelstein R C，et al.Vascular NAD（P）H oxidase is distinct from the phagocytic enzyme and modulates vascular reactivity control［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2001，280（2）：H658-67.

［5］Jones SA，O′Donnell V B，Wood JD，et al.Expression of phagocyte NADPH oxidase components in human endothelial cells［J］. Am JPhysiol，1996，271（4 Pt2）：H1626-34.

［6］王 成，韓衛(wèi)星，吳繼軍，等.纈沙坦對人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中 gp91Phox的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（6）：739-42.

［7］Zhang X P，Loke K E，Mital S，etal.Paradoxical release of nitric oxide by an L-type calcium channel antagonist，the R+enantiomer of am lodipine［J］.JCardiovasc Pharmacol，2002，39（2）：208-14.

［8］Nissen SE，Tuzcu EM，Libby P，etal.Effectofantihypertensive agents on cardiovascular events in patients with coronary disease and normal blood pressure：the CAMELOT study：a randomized controlled trial［J］.JAMA，2004，292（18）：2217-25.

［9］Salehi I，MohammadiM，Mirzaei F，et al.Amlodipine attenuates oxidative stress in the heart and blood of high-cholesterol diet rabbits［J］.Cardiovasc JAfr，2012，23（1）：18-22.

［10］Umemoto S，Tanaka M，Kawahara S，etal.Calcium antagonist reduces oxidative stress by upregulating Cu／Zn superoxide dismutase in stroke-prone spontaneously hypertensive rats［J］.Hypertens Res，2004，27（11）：877-85.

［11］Fan Y Y，Kohno M，Nakano D，et al.Cilnidipine suppresses podocyte injury and proteinuria in metabolic syndrome rats：possible involvementof N-type calcium channel in podocyte［J］.JHypertens，2010，28（5）：1034-43.

［12］Aoyama T，Minatoguchi S.The effectof ARB on prevention ofatherosclerosis［J］.Nihon Rinsho，2011，69（1）：92-9.

［13］Kim-Mitsuyama S.Pharmacological characteristicsof ARB and potential strategy to develop novel ARB［J］.Nihon Rinsho，2009，67（4）：812-8.

［14］Uchida T，F(xiàn)uruno Y，Tanimoto A，et al.Development of an experimentally usefulmodel of acutemyocardial infarction：2／3 nephrectomized triple nitric oxide synthases-deficient mouse［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，77：29-41.

［15］El Hassar C，Merzouk H，Merzouk S A，et al.Long-term use of angiotensinⅡ receptor antagonists and calcium-channel antagonists in Algerian hypertensive patients：effects on metabolic and oxidative parameters［J］.Free Radic Biol Med，2015，79：147-53.

Effect of am lodipine and valsartan on expression of the NADPH oxidase subunits gp91phoxand p22phoxin human coronary artery endothelial cell

Lu Nuonuo1，Han Weixing1，Liu Chao2，et al
（1Dept of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Histology and Embryology，AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To study the effect of amlodipine and valsartan on expression of Nicotinamide adenine dinu-cleotide phosphate（NADPH） oxidase subunits gp91phoxand p22phoxin human coronary artery endothelial cells（HCAEC）.Methods HCAEC were preincubated for 24 h，and the control group remained untreated，and the test groupswere treated with different concentrations of am lodipine（1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9mol／L）and different concentrations of valsartan（1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8mol／L）.The NADPH oxidase subunits protein expression were assessed by Western blot analysis.Results Expressions of gp91phoxand p22phoxwere significant in the experimental group and the control group.Am lodipine induced the expession of NADPH oxidase subunit p22phox（P＜0.05）.High concentrations of amlodipine significantly reduced expression of gp91phox，while low concentration promoted the expression of gp91phox（P＜0.05）.p22phoxand gp91phoxwere significantly inhibited by valsartan（P＜0.05），and the higher the concentration of valsartan，the greater the inhibiton（P＜0.05）.Conclusion Valsartan can inhibit oxidative stress.The higher the concentration，the greater the inhibition.Amlodipine suppresses part of NADPH oxidase subunit（gp91phox）only at high concentrations，but it may increase oxidative stress in low concentrations.

am lodipine；valsartan；human coronary artery endothelial cell；xidative stress；p22phox；gp91phox

R 541.4；R 972+.4

A

1000-1492（2016）02-0176-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.012.htm l

2015-11-17接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81070210）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230032

安徽醫(yī)科大學(xué)2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室、3第一臨床學(xué)院診斷學(xué)教研室，合肥 230032

盧挪挪，女，碩士研究生；

韓衛(wèi)星，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayhwx57＠163.com