牛奶中頭孢類藥物殘留的HPLC多聯檢測方法

（山東世通檢測評價技術服務有限公司，山東青島266000；青島世通檢測技術研究院，山東青島266000）

牛奶中頭孢類藥物殘留的HPLC多聯檢測方法

許娜，孫海新，張慧，黃金發，孫丕春

（山東世通檢測評價技術服務有限公司，山東青島266000；青島世通檢測技術研究院，山東青島266000）

采用高效液相色譜法（HPLC），建立了可同時檢測牛奶中頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩藥物殘留量的多聯檢測方法。樣品經超聲波振蕩，先后加入乙腈除蛋白，正己烷去除脂肪，經0.45μm和0.22μm有機超濾膜過濾，使用Agilent-C18反相色譜柱，以甲醇和0.1%甲酸溶液為流動相（V∶V=4∶6），流速為1m L/min，柱溫35℃，檢測波長為254 nm。該方法對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩4種頭孢類藥物的檢出限均為1.0μg/kg，在質量濃度為1.0～50.0μg/L范圍內具有良好線性關系，相關系數達到0.999，回收率為90%～105%，批內相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤20%。本方法具有分析時間短、檢測限低、精密度高、多聯檢測的優點，對于準確監控牛奶中頭孢類藥物殘留量具有重要意義。

高效液相色譜；頭孢；牛奶；藥物殘留；多聯檢測

0 引 言

頭孢類抗生素（Cephalosporins）藥物是臨床上用于治療細菌感染所導致疾病的常用藥物，屬于β-內酰胺類抗生素[1]，具有耐青霉素酶、療效高、毒性低、過敏反應少、抗菌譜廣等特點[2-4]，可有效抑制細菌的生長和繁殖。頭孢類抗生素在畜牧動物養殖中廣泛用于奶牛乳房炎的預防與治療[5]，動物尿道、胃腸道及呼吸道等的細菌病的治療和防治[6,7]。但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規定等多方面原因[8,9]，引發超劑量用藥的惡性循環，給人類帶來過敏、腸道菌群失調、耐藥性上升等嚴重危害[10]。因此，建立一種準確、快速的定量檢測方法對于實現該類藥物的有效監控具有重要意義。

1 實 驗

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，Agilent-C 18（4.6 mm×250mm，5μm）ZORBAX Eclipse Plus反相色譜柱，Cence/湘儀L500臺式自動平衡離心機，XW-80A漩渦混合器，CP225D電子天平，UGC-12C旋轉式水浴氮吹儀。

1.2 試劑

頭孢哌酮（編號130420，純度＞94.7%）、頭孢噻肟（編號130483，純度＞93.7%）、頭孢曲松（編號130480，純度＞91.8%）、頭孢噻吩（編號130407，純度＞96.3%），以上標準品；甲醇、甲酸、乙腈、正己烷（均為色譜純）；水為超純水；牛奶(全脂滅菌純牛乳)。

2 方 法

2.1 標準溶液的配置

混合標準品儲備溶液：分別準確稱取頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩標準品各10 m g，用甲醇-質量分數0.1%甲酸溶解并分別定容到4個100 m L棕色容量瓶中，配制成制成質量濃度為100 m g/L單標準品儲備溶液。再分別吸取適量單標準品儲備溶液轉移至1個100 m L棕色容量瓶中精確定容，配制成質量濃度為1 m g/L的混合標準品儲備溶液，備用。

混合標準工作液制備：用甲醇-質量分數0.1%甲酸溶液將混合標準品溶液經適當稀釋，配制成質量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/L的混合標準品工作液，備用。

2.2 樣品前處理

稱取5 g液態牛奶樣品置于離心管中（精確至0.01 g），加入15～20 m L乙腈，超聲波振蕩（超聲5 s，間隔5 s，60個循環），5 000 r/m in離心10 m in，取上清液，吸取上清液至試管中，氮氣吹干，加入等體積甲醇-質量分數0.1%甲酸溶液復溶，加入2～2.5 m L正己烷除脂，振蕩，5 000 r/m in離心10 m in，棄去正己烷，先后經0.45μm和0.22μm濾膜過濾后轉移至棕色瓶中，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent(C 18，4.6 mm×250 mm，5μm) ZORBAX Eclipse Plus反相色譜柱。

流動相：A-甲醇，B-0.1%甲酸溶液，A∶B（體積比）=4∶6。

流速為1 m L/m in；檢測波長為254 nm；柱溫為35℃；進樣量為20μL。

2.4 標準曲線繪制

將質量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/L的混合標準品工作液，采用高效液相色譜儀進行分析，每一水平設5個重復。以4種頭孢類藥物的峰面積平均值為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.5 結果計算

頭孢類藥物殘留量：

式中：X為試樣中頭孢類抗生素的殘留量，m g/ kg；C為試樣溶液中頭孢類抗生素的質量濃度，μg/ m L；V為最終樣液定容體積，m L；f為稀釋倍數；m為試樣量，g。（計算結果需扣除空白值。測定結果用兩次平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數字。）

3 結果與分析

3.1 方法線性方程和檢出限

采用HPLC測定牛奶中頭孢類抗生素的殘留量，流動相使用甲醇和0.1%甲酸溶液，配比為4∶6。結果顯示，樣品全部分析時間為12 m in，其中頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松在5 m in之內全部出峰，并且4種藥物可以完全分開（4種藥物標準溶液色譜圖詳見圖1）該方法在質量濃度為1.0～50.0μg/L范圍內具有良好線性關系（如圖2～圖5所示），相關系數達到0.999。其頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢噻吩線性方程、相關系數如表1所示。

采用空白樣品加目標化合物的測定方式，以信噪比S/N≥3所對應的濃度確定檢測限，以S/N≥10所對應的濃度確定定量限[11]，按照方法2.1進行處理，頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩4種頭孢類藥物的最低檢出限（S/N=3）均為1.0μg/kg，定限量（S/ N=10）均為2.0μg/kg。

表1 各化合物檢測結果

圖1 頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢噻吩標準溶液色譜

圖2 頭孢哌酮的標準曲線

圖3 頭孢噻肟的標準曲線

圖4 頭孢曲松的標準曲線

圖5 頭孢噻吩的標準曲線

3.2 準確度的測定

準確度是指測定值與真實值間的符合程度[12]，本研究采用樣品添加回收實驗，以及高效液相色譜儀分析的結果來反映方法的準確度。本方法的回收率的測定是運用在空白的牛奶樣品中添加不同質量分數水平的標準品，進行樣品的預處理，采用HPLC方法進行檢測，計算回收率。在質量分數為20.0μg/kg水平上添加4種頭孢類藥物，按本方法測定并計算回收率，每個添加水平重復測定3次，計算批內和批間變異情況，結果如表2所示。由表2可以看出，4種頭孢類藥物的回收率均在90%～105%之間，批內和批間RSD均小于15%。

表2 牛奶中頭孢類藥物加標回收率和精密度的測定結果(n=3)

4 討 論

在整個檢測體系的儀器選擇方面，本研究采用了高效液相色譜的方式，這是充分考慮到了高效液相色譜方法的穩定性、經濟性和高效性[13]，相對于更加昂貴和專業的液質聯用方法，更易于為廣大中小型乳制品生產企業的管理者和技術人員所接收。

樣品前處理是各類藥物殘留檢測都無法回避的環節，對于檢測體系的穩定性、準確性、靈敏度以及基質效應消除等方面都具有重要的影響[14]。在如乳制品的樣品前處理上，Tahira等[12]采用甲醇-質量分數為0.05%甲酸提取和SPE萃取凈化，采用2次高速離心使蛋白沉淀等雜質沉淀，但結果表明樣品測定結果仍不能消除基質效應影響。Abdalla等[4]用乙酸乙酯提取，甲醇萃取及梯度洗脫，結果仍有幾個很強的基質干擾峰。本研究中為了解決基質干擾的問題，綜合考慮樣品基質里含有的豐富蛋白質和脂肪等物質的影響，以及藥物殘留在其中的生物結合特點[15]。在解決藥物殘留與生物基質的結合性方面，采用了間歇性超聲波振蕩（超聲5 s，間隔5 s，60個循環）的方式，通過超聲波破壞藥物殘留與基質的結合，這對于提高準確度具有重要作用[16]；在解決蛋白質和脂肪的基質干擾作用方面，本研究通過加入乙腈去除蛋白，加入正己烷去除脂肪，并先后經0.45μm和0.22μm有機超濾膜過濾的方式進行解決，結果表明有效地避免了基質效應的干擾，有效分開個目標待測物。相比于一般樣品前處理中采用的SPE柱萃取的方式，本研究所采用的連續過超濾膜的方式更易于操作，節省物力和時間，對于提高檢測效率具有積極意義。

5 展 望

本研究已建立相關的樣品前處理程序和檢測參數優化，更需要進一步形成標準化操作規程，以適應乳制品的質量控制需要，另一方面，考慮到乳制品產品類型的日益多樣化，本研究所建立檢測技術體系的產業化推廣還需要在奶粉類產品、酸奶制品等常見產品中進行進一步的熟化，這需要在今后的工作中作進一步的完善。

[1]PARTA M.Impact of adopting minimum inhibitory concentration as the determinant of susceptibility to cephalosporins and carbapenems in multi-drug resistant Enterobacteriaceae[J].European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases,2012,31(6):975-80.

[2]SERGE K.Investigation of the pharmacokinetics and determination of certain cephalosporins in rabbit plasma by a kinetic spectrophotometric method with the aid of chemometrics[J].2011,

[3]CHO K J,KIM JK,LEE J-H,etal.Structural features of cephalosporin acylase reveal the basis of autocatalytic activation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2009,390(2):342-8.

[4]ELBASHIR A A,AHMED S M A,ABOUL-ENEIN H Y.New spectrofluorimetric method for determination of cephalosporins in pharmaceutical formulations[J].Journal of Fluorescence,2012,22(3): 857-64.

[5]SAMANIDOU V F,TSOCHATZIS E D,PAPADOYANNIS IN. HPLC determination of cefotaxime andcephalexine residues in milk and cephalexine in veterinary formulatio [J].Microchimica Acta,2008,160(4):471-5.

[6]NEUNER E A,R ITCH IE D J,MICEK S T.New antibiotics for healthcare-associated pneumonia;proceedings of the Seminars in respiratory and critical caremedicine,F,2009[C].

[7]NEMUTLU E,KIR S,KATLAN D,et al.Simultaneous multiresponse optimization of an HPLC method to separate seven cephalosporins in plasma and amniotic fluid:Application to validation and quantification of cefepime,cefixim e and cefoperazone[J].Talanta, 2009,80(1):117-26.

[8]GLINKA T,HUIE K,CHO A,et al.Relationships between structure,antibacterial activity,serum stability,pharmacokineticsand efficacy in 3-(heteroarylthio)cephem s.D iscovery of RW J-333441 (MC-04,546)[J].Bioorganic&M edicinal Chem istry,2003,11(4): 591-600.

[9]HECKER SJ,CALKINST,PRICEM E,etal.Prodrugsof cephalosporin RWJ-333441(MC-04,546)with improved aqueous solubility [J].Antim icrobialAgentsand Chemotherapy,2003,47(6):2043-6.

[10]TODA A,OHKIH,YAMANAKA T,et al.Synthesis and SAR of

novel parenteral anti-pseudomonal cephalosporins:discovery of FR 264205[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2008,18 (17):4849-52.

[11]KAC M,MARSEL J,POKORNY M.On the Analysisof Fermentation Broth during Biosynthesis of Cephalosporin Antibiotics[M]. Springer,1979.

[12]QURESH I T,MEMON N,MEMON SQ,et al.LC/UV determination of cefradine,cefuroxime,and cefotaxime in dairymilk,human serum and wastewater samples[J].SpringerPlus,2013,2(1):575.

[13]MILLER R,AFFOLDER C,NEUSSN.HPLC of cephalosporins and their oxa-derivatives[J].Experientia,1981,37(9):928-30.

[14]王玉堂,呂永輝.目前允許使用的漁藥構成與釋析[J].中國水產, 2008,1):61-7.

[15]ENGALYTCHEFF A,VANHELLEPUTTE J-P,TILQU IN B.HPLC detection and quantification of radiolytic products of eightβ-blockers irradiated in the solid state and hypotheses on their origins[J]. Pharmaceutical Research,2004,21(7):1103-9.

[16]SANLI S,SAN LI N,GUMUSTAS M,et al.Simultaneous estimation of ceftazidime and ceftizoxime in pharmaceutical formulations by HPLC method[J].Chromatographia,2011,74(7-8):549-58.

High performance liquid chromatography(HPLC)multigang determination method of cephalosporins in milk

XU Na,SUN Hai-xin,ZHANG Hui,HUANG Jin-fa,SUN Pi-chun
(Shandong Seatone Detection Evaluation Co.Ltd.，Qingdao 266000,China；Qingdao Seatone Detection Technology Institute,Qingdao 266000,China)

A HPLC method was established for the multi project joint determination of four cephalosporins(cefoperazone,cefotaxime,ceftriaxone,cefalotin)in milk.The milk sample was deproteinized by acetonitrile and degrease by hexane with ultrasonic technique,then filtered by organic-inorganic hybrid ultrafiltration membranes and detectd under the condition of Agilent-C18 reversed phase chromatographic column,with methanol solution and 0.1%phthalatesle solution(V∶V=4∶6)as mobile phase,flow rates1m L/m in,column temperature as 35℃, test wavelength as254 nm.The results showed that the four cephalosporins were good linear from 1～50μg/L,with minimum limits of detection were 1.0μg/kg respectively,and the correlation coefficients r2were greater than 0.999,the recoveries were at the levels90%～105%, intra-batch and inter-batch RSD were less than 15%and 20%respectively.The established multi project joint method can be applied for the determination of cephalosporins residue in milk within a short span of time,high minimum limits of detection,and high precision.

high performance liquid chromatography(HPLC);cephalosporin;milk;drug residue;multy determination

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0050-03

2015-09-07

國家火炬計劃項目（2015GH581533）；青島市技術創新平臺建設計劃項目（14-7-2-36-gx）。

許娜（1986-），女，工程師，研究方向為食品安全檢測與質量控制研究。

孫海新