液相色譜-質譜聯用法測定羅庫溴銨血藥濃度

蔣果廷　王婷婷　孫　申　郁韻秋△

(1復旦大學藥學院藥物分析教研室　上海　201203;2復旦大學附屬婦產科醫院麻醉科　上海　200090)

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液相色譜-質譜聯用法測定羅庫溴銨血藥濃度

蔣果廷1王婷婷2孫申2郁韻秋1△

(1復旦大學藥學院藥物分析教研室上海201203;2復旦大學附屬婦產科醫院麻醉科上海200090)

【摘要】目的建立液相色譜-質譜聯用 (liquid chromatography-tandem mass spectrum,LC-MS)方法測定血漿中羅庫溴銨濃度,并對靜脈注射0.9 mg/kg該藥物的患者2 h內的血藥濃度進行測定。方法血漿中加入內標鹽酸維拉帕米后用乙腈沉淀蛋白法進行處理,離心后取上清進樣。選用Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱分離,流動相為乙腈-甲酸銨 (60∶40，5 mmol/L,pH=5.5),流速1 mL/min,柱后三通分流,0.2 mL/min流量進入質譜。質譜采用電噴霧 (electrospray ionization,ESI)接口,選用正離子模式,檢測方式為選擇性離子監測 (selected ion monitor,SIM)模式。結果羅庫溴銨在0.1～10 μg/mL范圍內呈良好的線性關系,精密度及穩定性均符合生物樣本測定要求。結論LC-MS是一種簡單、快速、準確測定羅庫溴銨血藥濃度的方法,并成功應用于靜注2 h內臨床樣本的測定。

【關鍵詞】羅庫溴銨;液相色譜-質譜聯用;靜脈注射;選擇性離子監測

羅庫溴銨 (Rocuronium bromide)是一種甾類非去極化肌肉松弛劑,為季銨鹽結構，于1989年首次被報道[1],驗證其安全性和有效性后,于1994年在美國及英國上市,并于2000年以“愛可松”為商品名進入中國市場。相對于其他肌松藥,羅庫溴銨具有起效快、代謝產物少的優點,其主要經過肝臟代謝,膽道排除,經腎排泄只占次要地位[2-3],臨床用于開腹手術及腹腔鏡手術麻醉。

文獻中測定羅庫溴銨血藥濃度主要采用液質聯用的方法,前處理采用二氯甲烷提取法[4-5]或固相微萃取[6]等,過程較為復雜費時,給快速高通量檢測帶來困難，因此需要一種更為簡便可靠的測定方法來實現臨床監測。考慮到相關手術在2 h之內即可完成,手術過程實時監測，無需非常低的定量限,本課題預處理采用一步蛋白沉淀方法，簡化了實驗流程，并按照2015版《中國藥典》中《9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則》驗證了該分析方法，最終成功應用于臨床樣本(復旦大學附屬婦產科醫院麻醉科提供)的測定。本文建立了一種準確、可靠、方便的LC-MS法測定羅庫溴銨的血藥濃度,為治療藥物臨床檢測提供了依據。

材 料 和 方 法

儀器1260型高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)包括G1311B型Quat Pump四元泵、G1329B型ALS自動進樣器、AT330型色譜柱恒溫箱和OpenLAB CDS ChemStation Edition工作站,6120型四級桿質譜檢測器；TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器T)；GB204型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ER-182A型電子天平(日本A&D公司)。

試劑羅庫溴銨 (浙江仙琚制藥股份有限公司)，鹽酸維拉帕米 (99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，甲醇 (HPLC級,國藥集團化學試劑有限公司)，乙腈 (HPLC級,美國Biologic-Reagents公司)，甲酸 (HPLC級,美國Dikma Technologies公司)，甲酸銨 (98%,美國Anaqua Chemicals Supply公司)。

儲備液的配制GB204天平(萬分之一天平)精密稱取羅庫溴銨0.020 0 g,乙腈溶解并于100 mL容量瓶中定容,配成200 μg/mL儲備液;ER-182A天平(十萬分之一天平)精密稱取內標鹽酸維拉帕米0.002 50 g,甲醇溶解并于50 mL容量瓶中定容,配成50 μg/mL儲備液,均于4 ℃條件下儲存,臨用時稀釋至所需濃度。

工作液的配制取內標儲備液室溫放置,用乙腈稀釋到10 μg/mL。取羅庫溴銨儲備液室溫放置,用乙腈逐級稀釋得一系列標準溶液,濃度分別為200、150、100、40、20、10、4及2 μg/mL。再與濃度為10 μg/mL的內標溶液等體積混合,得到濃度為100、75、50、20、10、5、2及1 μg/mL的工作液 (含內標5 μg/mL),供標準血樣配制用。

標準血樣的配制取人空白血漿90 μL與上述方法配制的工作液10 μL混合,渦旋3 min。制得標準曲線樣品,濃度為10、5、2、1、0.5、0.2及0.1 μg/mL (含內標0.5 μg/mL),質控樣品濃度為7.5、1、0.2及0.1 μg/mL (含內標0.5 μg/mL)。

臨床樣本加內標向90 μL臨床樣本中加入10 μL濃度為5 μg/mL的內標溶液,渦旋3 min,制得含內標0.5 μg/mL的臨床血樣。

血漿樣品前處理向100 μL含內標血樣中加入300 μL乙腈,渦旋1 min,靜置5 min,之后采用6 640×g轉速離心10 min,取上清進樣。

液相色譜條件色譜柱:Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm);預柱:Phenomenex C18 (4 mm×3.0 mm);流動相:乙腈:甲酸銨 (5 mmol/L,pH=5.5,60∶40);流速:1 mL/min,三通柱后分流0.2 mL/min進質譜;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL;洗針溶液:60%乙腈水溶液。

質譜條件離子源:電噴霧接口 (electrospray ionization,ESI),正離子模式;干燥氣流速:12 mL/min;干燥氣溫度:350 ℃;霧化器電壓:35 psi;質譜檢測器:選擇性離子監測 (selected ion monitor,SIM)模式,通道1檢測藥物m/z=529.3,通道2檢測內標m/z=455.3。

結果

專屬性圖1A為空白血樣的SIM圖,圖1B為空白血樣加羅庫溴銨及內標的SIM圖,圖1C為患者2靜注0.9 mg/kg的羅庫溴銨90 min后采集血樣的SIM圖,結果顯示羅庫溴銨及內標在實驗條件下均有較好的保留與分離,羅庫溴銨和內標的測定處均未見明顯干擾。

線性范圍和靈敏度取羅庫溴銨濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5及10 μg/mL的標準血樣并按照“血漿樣品前處理”進行操作并進樣分析,得到羅庫溴銨以及內標的峰面積。以羅庫溴銨的理論濃度為自變量x,羅庫溴銨與內標物的峰面積比值為因變量y,并且以1/x2為權重,用加權最小二乘法作線性回歸。同時計算校正標樣回算濃度(表1)處于標示值的95.36%～103.39%,符合指導原則的要求。顯示本方法在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好。在S/N=10的條件下,可對濃度為0.1 μg/mL的羅庫溴銨血樣進行含量測定。

A:Blank plasma; B:Plasma spiked with Rocuronium bromide (0.1 μg/mL) and IS (0.5 μg/mL);C:Plasma collected at 90 min after intravenous injection of patient 2 spiked with IS (0.5 μg/mL).

圖1　LC-MS法測定人血中羅庫溴銨的典型色譜圖

a:y=0.001 870+0.651x;b:y=0.001 111+0.707x;c:y=0.003 607+0.676x.

精密度與準確度選取高 (7.5 μg/mL)、中 (1 μg/mL)、低 (0.2 μg/mL)以及定量限 (0.1 μg/mL)共4個濃度,另行配制。在同一天內對每一考察濃度平行配制5個樣品進行分析,連續測定3天,每日繪制隨行標準曲線。進行日內和日間精密度、準確度的考察。精密度以相對標準偏差 (relative standard devia-tion,RSD)進行衡量,準確度以方法回收率來衡量。

結果顯示(表2),本方法的日間和日內相對標準偏差 (RSD%)≤6.94%;方法回收率在85%～115%,僅有一個位于定量下限 (0.1 μg/mL)的樣品方法回收率115.2%,也在標準范圍 (定量下線為標示值±20%)之內，符合指導原則的要求。

基質效應和提取回收率選擇0.2、1、5 μg/mL 3個濃度進行基質效應的考察。由空白基質提取后加入分析物和內標測得基質存在下峰面積 (G1組),由分析物和內標的純溶液測得不含基質的相應峰面積 (G2組)。由峰面積之比得到待測物及內標的基質因子,并由此計算經內標歸一化的基質因子。結果如表3所示,3個濃度經內標歸一化的基質因子的變異系數均小于15%,符合指導原則的要求。

表2　分析方法的精密度與準確度

表3　各濃度樣品的基質效應

空白血樣加入分析物和內標,預處理后進樣得相應峰面積 (G3組),由G3組與G1組峰面積之比可求得提取回收率,3個濃度及內標的提取回收率分別為103.35%、101.98%、102.41%和104.89%,符合要求。

穩定性

樣品凍融循環穩定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL兩個濃度的模擬血樣,置于-20 ℃冰箱中,凍融3次后進行測定,結果為標示濃度的91.07%～103.23%。

短期放置穩定性配制0.2 μg/mL以及7.5 μg/mL兩個濃度的模擬血樣,樣品分別于4 ℃及25 ℃放置2、4 h后處理進樣,結果為標示濃度的89.12%～101.55%。

ALS放置穩定性實驗樣品處理后進樣并于4、8 h后重復進樣測定,結果為標示濃度的88.45%～109.82%。

以上測定結果與標示濃度相比較偏差均在±15%之內,符合指導原則的要求。

樣品測定按照所建立的方法,對兩組臨床樣本進行測定(圖2),考察靜注0.9 mg/kg的羅庫溴銨后2 h內的血藥濃度變化,取血時間分別為注射后5、10、20、30、60、90和120 min。

討論

色譜柱選擇羅庫溴銨是一類季銨鹽,在一般的反相色譜條件下不易保留。實驗中分別采用①Syncronis C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),②Venusil XBP Phenyl (2.1 mm×100 mm,5 μm),③Luna NH2(4.6 mm×250 mm,5 μm),④Syncronis HILIC (2.1 mm×100 mm,5 μm)和⑤Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm)等柱子進行了嘗試,結果顯示⑤號柱對羅庫溴銨和內標均有較好保留。故本實驗選擇⑤號柱進行分離。

色譜條件優化以乙腈-水為流動相,分別對有機相的比例和水相pH進行了考察,綜合考慮保留時間和峰形后,選擇乙腈水相為60∶40,水相pH為5.5 (5 mmol/L甲酸銨,用甲酸調節pH)。此外,將柱溫由30 ℃升至40 ℃時,峰形明顯改善。

質譜條件選擇確定色譜條件后,進樣質譜掃描 (掃描范圍150～600),得總離子流圖,根據羅庫溴銨以及內標相對應的保留時間質荷比情況最終選擇m/z=529.3檢測羅庫溴銨以及m/z=455.3 檢測內標鹽酸維拉帕米(圖3)。

本實驗根據相關指導原則,建立了LC-MS聯用的方法來測定靜注2 h內羅庫溴銨血藥濃度的方法,并成功應用于臨床樣品的測定,為藥物臨床監測及相關研究提供了依據。

參考文獻

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Quantitative determination of Rocuronium bromide in human plasma by a liquid chromatography-tandem mass spectrum method

JIANG Guo-ting1, WANG Ting-ting2, SUN Shen2, YU Yun-qiu1△

(1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China;2DepartmentofAnesthesiology,ObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200090,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrum (LC-MS) method to determine the concentration of Rocuronium bromide in plasma． The method was applied to the plasma of patients who use the drug via intravenous injection within 2 hours．MethodsAfter addition of Verapamil Hydrochloride as internal standard (IS),plasma samples were precipitated by acetonitrile.After centrifuging,the supernate was taken to analysis． The separation was carried out on an Atlantis T3 (4.6 mm×150 mm,5 μm) column,and the mobile phase was acetonitrile-ammonium formate (60∶40,5 mmol/L,pH=5.5) at a rate of 1 mL/min with a three-way valve after the column to separate the flow and control the flow which runs in the mass spectrum at a rate of 0.2 mL/min． An electrospray ionization (ESI) was adopted as the interface.The samples were detected in positive mode with selected ion monitor (SIM)． ResultsA good linearity was obtained in the range of 0.1～10 μg/mL,and the accuracy,stability and other parameters of the method meet the detecting require for biological samples.ConclusionsLC-MS method is a simple,rapid and accurate method that can be applied to measuring the concentration of Rocuronium bromide in plasma,and it′s also succeed in measuring the clinical samples within 2 hours．

【Key words】Rocuronium bromide;liquid chromatography-tandem mass spectrum method;intravenous injection;selected ion monitor

(收稿日期:2015-09-01;編輯:王蔚)

【中圖分類號】R917

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.016

△Corresponding authorE-mail:yqyu@shmu.edu.cn