降溫速率對聚乙烯吡咯烷酮水溶液結晶的影響

李維杰，王利紅，劉寶林，周新麗

(1-上海理工大學生物熱科學研究所，上海 200093；2-上海交通大學附屬第六人民醫院，上海 200233）

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降溫速率對聚乙烯吡咯烷酮水溶液結晶的影響

李維杰1，王利紅*2，劉寶林1，周新麗1

(1-上海理工大學生物熱科學研究所，上海 200093；2-上海交通大學附屬第六人民醫院，上海 200233）

[摘 要]聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一種重要的非滲透性低溫保護劑。本文使用低溫顯微鏡，研究了不同濃度（10％、20％和30％）PVP水溶液在不同降溫速率（1oC/min、10oC/min、50oC/min和100oC/min）的結晶形態以及初始結晶溫度。研究結果表明，在較低濃度條件下結晶顆粒較大，容易出現冰溝壑；在較高濃度條件下，冰晶顆粒相對較小，未見明顯的冰溝壑產生；此外，初始結晶溫度隨著降溫速率的增加而降低。在適當的高濃度條件下提升降溫速率可以有效減少結晶量，有利于低溫保存。

[關鍵詞]聚乙烯吡咯烷酮；結晶；降溫速率；低溫保存

*王利紅（1976-），女，副主任醫師，博士。研究方向：女性生育力保存。聯系地址：上海市第六人民醫院生殖醫學中心，郵編：200233。聯系電話：021-24056369。E-mail：lihongwang1976@126.com。

0 引言

聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一種多聚體化合物，作為一種非滲透性低溫保護劑，被廣泛用于低溫生物保存中[1]，在細胞低溫保存中常常與糖類復配使用，主要通過與糖類間的氫鍵作用來改變保護劑玻璃化溫度，這樣可以降低單一低溫保護劑的濃度，從而達到玻璃化效果且降低溶質毒性對細胞的損傷[2]。YAO等[3]使用15％EG和2％PVP實現了卵母細胞在較低的降溫速度下玻璃化，取得較好的保存效果。SCHMID等[4]使用液滴法冷凍紅細胞，結果發現添加適量的PVP有助于細胞冷凍后的恢復。權國波等[5]對PVP應用于紅細胞低溫保藏的可行性進行了探討，認為控制保護劑的溶劑損傷十分必要。盧榮華等[6]利用PVP保存豬前體細胞，發現PVP濃度對低溫保存有顯著影響。LV等[7]使用低溫顯微鏡觀察納米粒子對PEG-600溶液結晶形態的影響，發現加入粒徑為60 nm、濃度為0.4％的羥基磷灰石納米顆粒可以增加反玻璃化溫度10oC，并且結晶形態更加明顯。GUHA等[8]利用LinkamTM低溫顯微系統測試無血清等存在的情況下以10％ PVP （w/v）為低溫保護劑，成年人干細胞內冰晶形成情況，結果發現PVP能夠對細胞脫水，可以有效抑制結晶初期的冰晶形成，從而減少胞內冰的數量。低溫顯微鏡作為一種重要的研究工具，低溫顯系統作為一種形象直觀的手段，可以有效地觀測到冷凍保護劑在降溫過程中的結晶、玻璃化、反玻璃化、共融等現象，同時可以記錄該現象發生的溫度、升降溫速率等參數[9-11]，對低溫保護劑的篩選有重要的意義。

本文使用低溫顯微鏡系統，分別比較了濃度分別為10％、20％和30％的PVP低溫保護劑，在1oC/min、10oC/min、50oC/min和100oC/min的降溫速度中的冰晶形態，比較不同降溫溫速率對溶液結晶形態和結晶溫度的影響。

1 材料與方法

1.1 低溫顯微鏡系統

實驗使用的低溫顯微鏡系統由BCS196生物冷凍臺、T95程序溫度控制器、Linksys 32溫度控制軟件、自動冷卻系統（Linkham Scientific Instruments Limited,UK），以及BX51TRF型顯微鏡（Olympus,Japan）組成，如圖1所示。該系統通過控制樣品臺的加熱和液氮流量調節升降溫速度，可以在-196oC～125oC范圍內，以(0.01～150)oC/min的速率實現樣品的冷凍及復溫，此外還提供最高5,000oC/min的極速淬冷降溫，該系統結構緊湊、控制精度較高[12]。低溫載物臺置于顯微鏡物鏡下，通過顯微鏡系統可以直接觀察實驗樣品在冷凍和復溫過程中的冰晶形態變化以及溶液的相變過程，也可以通過系統自帶的攝像頭采集圖像并由計算機實時顯示。結合圖像采集及處理技術，可以對冷凍過程進行定性及定量研究。

圖1　低溫顯微鏡系統

1.2 實驗方法

本文選取聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40，Amresco，美國）作為試劑。使用微量移液器吸取1 μl冷凍保護劑液滴到石英坩堝上，將蓋玻片壓在液滴上，使得液滴被壓成一個平面，其厚度可以忽略。石英坩堝加載到低溫臺，分別采用1oC/min、10oC/min、50oC/min和100oC/min的降溫速率冷卻，觀察冰晶的形態和出現時機。

2 結果與討論

2.1 降溫速率對不同低溫保護劑結晶形態的影響

如圖3所示，低濃度情況下10％PVP不論降溫速度如何，均出現了較大的溝裂，1oC/min、10oC/min和50oC/min時形成的溝裂較大且紋路清晰，冰晶紋路由不同方向產生，說明冰核在保護劑的不同位置同時發生，冰晶逐漸長大，其前鋒逐漸相遇，在相遇處相互擠壓，產生了冰溝壑，降溫速度相對較慢時，異向成核現象比較嚴重，單個冰晶尺寸較大，較容易發生膨脹造成冰晶碎裂[7]。

當降溫速度達到100oC/min時，溝裂明顯減小，這說明盡管濃度較大，提升降溫速率依然可以阻礙保護劑形成較大的冰晶，減少大冰晶之間的互相擠壓產生碎裂和溝壑[13]。

提升PVP濃度至20％時，任何降溫速率下均未出現較大的冰溝裂，當以1oC/min的降溫速度降溫時形成較大的顆粒狀冰晶，其直徑最高可以達到5 μm，有較大的棱角，可能對細胞壁表面構成威脅，當降溫速率提升到10oC/min時，反而出現了裂紋，但較10％時裂紋較小，提升降溫速度為50oC/min出現了彗星狀冰晶，盡管冰晶尺寸較大，但未發現有較明顯的溝壑和棱角。當降溫速率升高到100oC/min時出現了較為柔和的小溝壑，溝壑較淺，對細胞的威脅也較小。當PVP濃度提升到30％時，均未出現較大的溝壑，當降溫速度為1oC/min時冰晶較細膩，直徑小于1 μm，但仍然出現了裂紋，當速度升高至10oC/min和50oC/min時無明顯的結晶出現，但顯微鏡視野中整體顏色較深；主要原因是降溫過程有細微的冰晶形成，冰晶的方向性各異，使得透光率下降[14]、視野發黑；當降溫速度提升到100oC/min時，視野亮度明顯升高，證明冰晶總量下降，保護劑實現了部分玻璃化。

因此提高降溫速率和保護劑濃度有利于減少冰晶的形成，減少冷凍過程中對細胞的冷凍傷害。溶液濃度不能無限制提高，過高的濃度可能會造成對細胞的溶液傷害[15]。

提高降溫速率可以有效減少大結晶數量，如圖2(e)，視野中大概有5,000個直徑為1 μm的大冰晶；而對于高速情況下（圖2(h)所示），視野中并無直徑大于1 μm的大冰晶。因此，高速降溫有利于低溫保存，從圖像上看出，濃度為30％、降溫速度為100oC/min時，幾乎看不到直徑超過1 μm的結晶，保存效果最好。

圖2　不同濃度PVP在不同降溫速度下結晶形態

2.2 降溫速率對冰晶不同濃度低溫保護劑結晶溫度的影響

圖3為降溫速率對不同濃度低溫保護劑結晶溫度的影響。由圖可知，相同濃度的PVP保護劑的結晶溫度隨著降溫速率的升高而降低。以10％的PVP為例，當以1oC/min的速度降溫時，結晶溫度為-13.6oC；當降溫速率為10oC/min時，結晶溫度為-13.8oC；當降溫速率升溫50oC/min時，結晶溫度為-15.7oC；而當降溫速率達到100oC/min時，其結晶溫度為-16.0oC；可見提高降溫速率能有效降低結晶溫度。

對于20％的PVP和30％的PVP，其不同降溫速度下的結晶溫度均比10％濃度高，且相同降溫速率下溶液濃度越高結晶溫度越低，可見高濃度的低溫保護劑，在抑制冰晶方面有一定的效果[16]。降溫速率越快，結晶速度越低，這可能與設備的熱慣性相關；在實際的冷凍過程中，通常采用較高的冷凍速度，快速通過危險的結晶區域，以防止冰晶的生長造成對細胞內外的傷害。當降溫速度加快時，不同濃度下結晶溫度的離散性加強，這說明結晶過程是一個隨機的過程，在快速降溫過程中隨機性更強。

BORSOS等[17]建立的結晶模型中顯示晶核的形成和冰晶的成長具有隨機性，結晶的出現除了和保護劑濃度降溫速率有關外，還與接觸表面的粗糙度、材質相關、是否有雜質有關。

圖3　降溫速率對不同濃度低溫保護劑結晶溫度的影響

3 結論

聚乙烯吡咯烷酮作為一種重要的低溫保護劑，在低溫保護中確實能起到減少冰晶的作用，但濃度要求較高，單獨使用時濃度大于10％、降溫速率大于50oC/min，才能有效抑制胞外冰的形成，但是濃度過高時會由于自身毒性原因對細胞有額外損傷，因此濃度的選擇一定要慎重。實際使用中為了減少濃度對細胞的損傷，可以使用復配的方式降低單一成分的濃度。結晶初始溫度隨著降溫速度增加而降低，低濃度條件下結晶顆粒較大，容易出現冰溝壑，高濃度條件下冰晶顆粒相對較小。在高濃度條件下提升降溫是一種有效降低溶液冰晶損傷的方式。

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Effect of Cooling Rate on Crystallization of Polyvinylpyrrolidone Aqueous Solution

LI Wei-jie1,WANG Li-hong*2,LIU Bao-lin1,ZHOU Xin-li1
(1-Institute of Biothermal Technology,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2-Shanghai JiaoTong University Affiliated Sixth People`s Hospital,Shanghai 200233,China)

[Abstract]Polyvinylpyrrolidone (PVP) is an important impermeable cryoprotectant.Cryomicroscope was used to study the initial crystallization temperatures and the crystalline forms of Polyvinylpyrrolidone aqueous solution with different concentrations (10％,20％ and 30％) at different cooling rates (1oC/min,10oC/min,50oC/min and 100oC/min).The results show that,the sizes of crystals are relatively bigger and the ice gap tends to take shape when PVP is at lower concentration; the sizes of crystals are relatively smaller when PVP is at higher concentration ,and no obvious ice gap occurs; moreover,the initial crystallization temperature decreases with the increase of cooling rate.Crystals can be effectively reduced by accelerating the cooling rate when PVP is at higher concentration,which is beneficial to cryopreservation.

[Keywords]Polyvinylpyrrolidone; Crystallization; Cooling rate; Cryopreservation

基金項目：國家自然科學基金資助（No.81300554）。

doi：10.3969/j.issn.2095-4468.2016.01.107