豬圓環病毒2型 GZ-ZYSY株全基因組的克隆與序列分析

王招弟，吳好葉，嚴莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇，代振江

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒2型 GZ-ZYSY株全基因組的克隆與序列分析

王招弟，吳好葉，嚴莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇*，代振江

(貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒2型（PCV2）是目前嚴重危害養豬業的疾病之一，給我國養豬業造成了嚴重的經濟損失[1]。崔亞蘭等對2007—2011年收集的4 980份貴州各地區豬只血清樣品進行PCV2抗體檢測，發現陽性率為43.45%，且呈逐年上升趨勢，對2011年收集的133份豬組織樣品進行了PCV2病原核酸檢測，發現其陽性率高達77.44%，說明PCV2在貴州省廣泛流行且日益嚴重[2]。為豐富貴州PCV2全基因組序列庫，了解貴州地區PCV2遺傳變異情況，本研究從PCV2抗體檢測為陽性的血清中克隆測序了一株PCV2全基因組序列，命名為GZ-ZYSY，并對其進行了生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 血清、質粒

血清系貴州遵義綏陽某豬場送檢，PMD19-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌感受態TOP10由中國獸藥監察所惠贈。

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒、限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ，LA Taq聚合酶，DNA DL2000 Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit (50) 膠回收試劑盒購自美國Omega公司；普通質粒微量提取試劑盒購自TIANGE公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計與合成

根據GeneBank公布的PCV2序列設計擴增PCV2全基因組序列且攜帶酶切位點的引物，引物序列如表1所示：

表1 本研究中所使用的引物

1.4 PCV2全基因組的擴增

用核酸提取試劑盒提取送檢血清的混合核酸，以其為模板，用設計的引物對PCV2全基因組進行PCR擴增，體系和條件如下：模板8μL，dNTP 8μL，10×LA Buffer 5μL，LA Taq酶1μL，上下游引物各2μL，ddH2O 12μL。條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。

1.5 目的基因的克隆和測序

將PCR產物進行電泳，90 V，40 min，用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，將回收產物連接至PMD19-T，轉化至TOP10大腸桿菌，涂板培育，挑取陽性菌落，抽提質粒，進行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切與質粒PCR鑒定，將鑒定為陽性的質粒送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.6 PCV2全基因組序列的生物信息學分析

用DNAStar對擴增的PCV2全基因組序列和GeneBank公布的目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）進行相似性分析。

2 結果

2.1 PCV2全基因組序列的擴增

以從血清中提取的混合核酸為模板，用設計的引物對PCV2全基因組序列進行擴增，將PCR產物進行電泳，顯示目的條帶為1 800 bp左右，與預期大小相符。電泳結果如圖1。

2.2 PCV2全基因組序列相似性分析

根據2008年歐盟豬圓環病毒疾病委員會提出的PCV2分型標準可知[3]，GZ-ZYSY株屬于PCV2a型，將GZZYSY株氨基酸序列與目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）進行相似性比較，結果如圖2所示，各疫苗株中與GZ-ZYSY株相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1） 疫苗株，相似性為93.2%。多重比對結果如圖3所示，GZ-ZYSY株與4株疫苗株的ORF2氨基酸序列相比存在23個氨基酸的差異。

圖1 PCV2全基因組PCR擴增結果

圖2 GY-ZYSY株與疫苗株的氨基酸序列的相似性比較

圖3 GY-ZYSY株與疫苗株ORF2氨基酸序列的多重比對

3 討論

本文從PCV2抗體陽性的血清中擴增獲得了一株PCV2全基因組序列，序列分析發現其為PCV2a型，由此推測是否PCV2a型較PCV2其他基因型更能維持較長的病毒血癥時間。氨基酸序列的相似性分析發現，GZ-ZYSY株與市面上流行的疫苗株中相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1）疫苗株，相似性為93.2%，各疫苗株之間的相似性在92%～99.7%之間。氨基酸序列多重比對發現GZ-ZYSY株與各疫苗株的ORF2之間存在23個氨基酸的差異，這些氨基酸差異是否會導致其與疫苗株之間抗原出現較大差異有待進一步研究。本研究豐富了貴州地區PCV2的基因組序列庫，對貴州PCV2的防控提供了一定參考。

[1] 李玲，李國新，周艷君，等. 2008—2011年中國部分地區豬圓環病毒2型的分子流行病學調查[J].中國動物傳染病學報，2012（2）：1-10.

[2] 崔亞蘭，王開功，張華，等. 2007—2011年貴州省豬圓環病毒感染的流行病學調查[J]. 畜牧與獸醫，2013，45（3）：70-73.

[3] CORTEY M，OLVERA A，GRAUROMA L， et al. Further comments on porcine circovirus type 2 ( PCV2) genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol， 2011，149：522-523.

2016-09-14)

省校合作計劃項目, 黔科合LH字[2014]7670號

王招娣（1993—），女，在讀學士，研究方向：動物傳染病病原分子生物學。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導師，從事動物傳染病病原分子生物學研究