豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環病毒2型混合感染的診斷分析

李明波，宋忠旭，董斌科，孫 華，雷 斌，梅書棋＊＊

(湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430209）

豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環病毒2型混合感染的診斷分析

李明波，宋忠旭，董斌科，孫 華，雷 斌，梅書棋＊＊

(湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430209）

豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環病毒病是目前養豬業廣泛存在且危害較大的疾病，嚴重影響了種豬的繁殖性能和仔豬的生長性能，多表現為地方性流行和持續性感染，是其他豬病多發和頻發的主要原因。2016年5月，湖北省某規模化豬場內育肥前期豬只出現以呼吸困難、高熱、皮膚出現不規則丘疹、漸行性消瘦等臨床癥狀的急性傳染病，造成豬只生長發育受阻、飼料轉化率降低。根據臨床癥狀，結合流行病學、臨床剖檢觀察、實驗室診斷等方法，最終確診其為豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環病毒2型的混合感染引起，同時對檢測數據進行分析并采取相應措施，有效減緩了疾病的流行與蔓延。研究通過對該場疾病發生的原因及防控措施進行分析，以期為當前養殖場該類疾病的臨床防控提供參考。

豬繁殖與呼吸綜合征；豬圓環病毒2型；診斷分析

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（P orcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viruses，PRRSV）引起的豬高度接觸感染性傳染病。該病主要引起初胎和妊娠后期母豬的流產、產死胎、高熱等；哺乳仔豬、保育豬最易感染出現臨床癥狀或者繼發其他細菌性疾病如鏈球菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等，病死率較高，以出現發熱、眼結膜水腫、呼吸衰竭、關節腫脹、間質性肺炎等綜合癥狀為主。病毒可經呼吸道、胎盤、公豬精液感染傳播[1]。研究表明，當前我國養殖場主要流行變異的PRRSV，且不同毒力的毒株引起的臨床癥狀具有較大差異[2，3]。

豬圓環病毒病2型（Porcine Circovirus，PCV2）是新近發現的最小的DNA病毒，基因組大小為1 766 bp。該病可以感染各年齡階段的豬只，包括斷奶仔豬的多系統衰竭綜合征（PMWS）、出生豬的先天震顫和生長豬的皮炎腎病綜合征、增生性腸炎、妊娠母豬產死胎等。斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning Muhisystemic Wasting Syndrome，PMWS）是臨床較常見也是造成經濟損失最大的豬圓環病毒病。臨床患PMWS的仔豬表現為皮膚蒼白、呼吸道癥狀、進行性消瘦、腹股溝淋巴結腫大和生長不整齊，容易繼發細菌感染等。該病可經豬的糞尿、鼻腔、乳汁、胎盤和公豬精液等途徑傳播[4，5]。

PRRSV和PCV2是引起豬群免疫抑制性疾病的重要病原。臨床上，PRRSV和PCV2感染與其他病原體感染引起的呼吸系統疾病表現極為相似，并常伴隨混合感染和繼發感染。根據流行病學、臨床表現以及剖檢變化很難做出準確診斷，需要結合病原學和血清學等方法來做出綜合判斷。

2016年5月，湖北省某規模化豬場內育肥期豬只出現急性呼吸系統疾病，發病率20%左右，發病豬臨床癥狀表現為食欲減退、陣發性咳嗽、高熱（體溫41 ℃以上）、皮膚出現不規則紅紫斑及丘疹；嚴重病例表現為呼吸困難、漸行性消瘦、被毛粗亂及蒼白等癥狀。為切實掌握發病情況，本研究結合流行病學、臨床剖檢觀察、實驗室病原學診斷等方法，最終確診其為豬藍耳病與豬圓環病毒2型的混合感染引起。同時采取綜合防控措施，及時了解疾病的發展規律，有效減緩了疾病的暴發與蔓延。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇該規模化豬場內臨床癥狀典型的發病豬只2頭；無菌抽取保育階段健康豬只血樣10份、疑似發病的育肥期豬只血樣20份，冷藏保存后送至華中農業大學動物疫病診斷中心檢測。

1.1.1 主要儀器

德國eppendorf離心機勻漿機，PCR儀，Bio-RAD凝膠成像系統，DYY-7C電泳儀等。

1.1.2 引物及試劑

擴增PRRSV部分NSP2序列及PCV2 ORF2基因引物，Taq DNA polymerase（PCR聚 合 酶 ）、dNTPs、 反轉錄試劑盒及DNA快速回收試劑盒為上海生工生物工程產品，Trizol總RNA提取試劑盒為Omiga公司產品，DL 2000 DNA Marker等均為大連寶生物公司（TaKaRa）產品。陽性對照樣品由華中農業大學動物傳染病診斷中心保存。

1.2 檢測方法

1.2.1 流行病學調查和臨床剖檢

了解評估該養殖場內種豬群和各階段生長豬只前期主要疫病的血清抗體和病原檢測結果，以及豬群疫苗免疫程序等防控措施，觀察發病豬只臨床癥狀，選取2頭發病豬只進行解剖，記錄病例剖檢變化。

1.2.2 主要疫病血清抗體的檢測

無菌抽取保育階段健康豬只血樣10份、疑似發病的育肥期豬只血樣20份，分離血清后采用ELISA（酶聯免疫吸附試驗）抗體檢測試劑盒分別檢測PRRS抗體、PCV2抗體、偽狂犬gE抗體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗體（ApxIV）等。ELISA抗體檢測試劑盒為武漢科前生物制品公司產品。

1.2.3 血清中主要疫病病原的檢測

按RNATrizol試劑說明書提取血清中病毒總基因組，進行PRRSV、PCV2等疑似病原的檢測。采用PCR方法擴增PCV2 ORF2基因，樣品中有PCV2存在時，可擴增出494bp的片段，PCR引物為：上游引物：5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′。另采用RT-PCR方法擴增PRRSV NSP2基因中覆蓋變異毒株缺失區域的基因片段，樣品中有變異性PRRSV時，可擴增出678bp的片段；樣品中有經典PRRSV時，可擴增出768bp的片段。PCR引物為：上游引物（Dnsp-1161）：5’-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3’，下游引物（Dnsp-1928）：5’-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3’（ 下 劃 線代表兼并堿基），基因特異性反轉錄引物(RTnsp-2850)：5’-AGAATGAAGGA-3’。

2 結果與分析

2.1 流行病學調查結果

初步評估該場前期對疑似發病豬組織樣的檢測結果，發現場內存在變異PRRSV、PCV2的感染和流行，在防控PRRS上使用某公司生產的JXA1-R株減毒活疫苗免疫分娩后母豬和配種前后備豬，育肥階段豬只未免疫PRRS疫苗；場內前期監測到的PCV2病原為PCV2b亞型，種豬和生產仔豬均免疫PCV2全病毒滅活疫苗。通過了解，該養殖場自2011年起開展了豬瘟、豬偽狂犬病凈化等方面的工作，目前已達到凈化的目標。

2.2 臨床癥狀及剖檢變化

本次發病的豬只為保育轉入育肥階段群體，平均體重30 kg以上，發病豬最初以高熱（41.5 ℃），表現出急、慢性呼吸道疾病呈腹式呼吸，鼻腔有黏稠黏液，眼結膜潮紅且分泌物增多，部分豬只背部有不規則丘疹，早期應用林可霉素、5%黃芪多糖、維生素C等復合制劑進行隔離治療后轉歸，但生長受阻；嚴重病例的表現為食欲減退、蒼白消瘦乃至呼吸衰竭致死（圖1），個別病豬排出黃色水樣稀糞。

對急性發病豬只和瀕死的豬只進行解剖檢查，發現病變多表現為：心包有積液、肺臟組織水腫出現蝦肉樣病變、全身淋巴結腫大出血，尤其是腹股溝和腸系膜淋巴結腫大充血明顯（圖2），腎臟色澤變淡，1頭重癥豬只脾臟嚴重腫大淤血。

圖1 發病豬臨床癥狀

圖2 發病豬只剖檢癥狀

2.3 主要疫病血清抗體檢測結果

使用商品化試劑盒分別檢測10份保育豬和20份育肥期豬只血清中豬藍耳病（PRRS）、豬圓環病毒2型(PCV2)、偽狂犬gE野毒（PRV-gE）、豬胸膜肺炎放線桿菌（ApxIV）抗體，陽性/陰性樣品判定標準參照試劑盒使用說明，檢測結果如表1所示。

表1 血清學抗體檢測結果

圖3 血清中PRRSV RT-PCR擴增產物

圖4 血清中PCV2 PCR擴增產物

2.4 血清中主要疫病病原的檢測結果

通過RT-PCR或PCR方法對20份疑似發病的育肥豬血清樣品進行了PRRSV、PCV2病原的檢測，結果表明20份樣品中檢出PRRSV變異毒株陽性比例為80%，檢出PCV2病原陽性比例為100%，PCR擴增結果如圖3、圖4所示。

3 討論

3.1 病因分析

1）從檢測結果來看，10頭保育階段健康豬只未檢測出PRRS抗體，說明此階段豬只未感染PRRSV，且PCV2疫苗免疫抗體陽性率為100%（抗體均值為0.502），這部分豬從臨床來看健康水平也較好；20頭疑似發病育肥豬血清中檢出PRRS抗體陽性率為95%，說明在保育轉育肥階段或許就感染了PRRSV，這個也可從血清中PRRSV的病原檢測結果反應出來，其病原陽性率為80%（16/20），從RT-PCR擴增結果來看，PRRSV信號為弱陽性，說明豬只個體被感染的病毒劑量還不是很大，但卻可以誘發細菌性疾病以及PCV2在豬體內復制能力增強，從而導致呼吸系統疾病，這些很好解釋了當前該場育肥期豬只病情不穩定的一些問題。下步將對血清樣品中檢測出的PRRSV、PCV2病原分別進行GP5和ORF2基因序列測序分析，進一步明確毒株的來源和其在該場的傳播規律。

2） PCV2與PRRS都屬免疫抑制性疾病，可以互相促進感染增殖，從育肥豬PCV2病原檢測結果來看，PCR擴增信號為強陽性，雖然該場在仔豬21日齡已進行該病的疫苗免疫，但是已有研究表明，不管是PCV2還是PRRSV，豬只免疫2種疫苗后都不能完全清除體內病毒，只能在一定程度上減少病毒血癥時間或者部分抑制豬只排毒[6]。PCV2感染后可誘發呼吸系統疾病，姜平等研究表明熱應激促進PCV2的復制與Hsp70（熱休克蛋白）和Hsp27蛋白相關，這或許可以解釋夏季PCV2感染能力增強的一些原因，如豬的皮炎腎病綜合征（圖1所示）。

3）保育和育肥階段豬群中均未檢測到豬胸膜肺炎放線桿菌抗體和偽狂犬野毒抗體。從疫病流行病學、臨床癥狀、病理變化及實驗室檢測結果來看，育肥前期豬只疫病的發生有以下幾個原因：一是PRRSV+PCV2感染是誘因，導致繼發細菌性疾病如多殺性巴氏桿菌、支原體等感染的現象；二是該場豬群及飼養環境控制力度不夠，不同日齡階段的豬部分混群、欄舍飼養密度大等；三是養殖場現有防疫與生物安全防控基礎條件不足，且豬舍主動通風和除塵措施較差；四是夏季蚊蟲多發，通過交叉傳播增加了病原感染幾率。

3.2 防控措施

1）加強飼養管理，重視場內環境衛生工作，嚴格執行空圈欄舍的徹底消毒沖洗和消毒管理制度。實行定期帶豬消毒，保持豬舍環境清潔衛生、干燥、通風良好，同時做到豬群轉群全進全出，各生長階段飼養豬群分區飼養，降低飼養密度。并及時將發病豬只和健康豬進行隔離飼養及治療。

2）豬群轉群后飼料中通過脈沖給藥方式進行控制，添加10%替米考星1 000 mg/kg+黃芪多糖10～15 d，同時在飲水中添加葡萄糖、電解多維增強豬體質，減少應激反應。

3)保育階段仔豬（35日齡左右）加強免疫PRRS疫苗一次，1頭份/頭，圓環病毒2b亞型滅活疫苗調整為28日齡免疫，1頭份/頭。

該養殖場通過實施上述防控方案及進一步加強飼養管理和生物安全防控措施后，有效降低了發病豬死淘率，豬群健康水平出現好轉，豬場情況趨于穩定。

[1] BARBARA E S ，JEFFERY J Z， SYLVIE D A，et al.豬病學[M]. 9版.北京：中國農業大學出版社，2008： 423-445.

[2] 薛青紅，張彥明，劉湘濤，等.中國部分地區2005-2007年豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株ORF5基因和Nsp2基因遺傳變異分析[J].中國農業科學，2009，42(5)：1805-1802.

[3] LENG C L，TIAN Z J，ZHANG W C，et al.Characterization of two newly emerged isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from Northeast China in 2013[J]. Veterinary Microbiology ，2014，171： 41-52.

[4] 韋平，秦愛建.重要動物病毒分子生物學[M].北京：科學出版社，2008：478-496.

[5] 李文潔，李文濤，嚴偉東，等.中國部分地區豬圓環病毒2型的基因型分析[J].畜牧獸醫學報，2009，40（9）：1358-1362.

[6] MENGELING W L， LAGER K M， VORWALD A C，et al.Strain specificity of the immune response of pigs following vaccination with various strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Microbiol，2003b，93：13-24.

2016-07-19）

農業部國家生豬產業技術體系武漢綜合試驗站項目（編號：CARS-36)；十三五創新團隊項目（編號：2016—620—004—001）。

李明波（1982-），男，湖北宜都人，碩士，助理研究員，研究方向：豬傳染病的病原學診斷和臨床防控技術(E-mail：lmb409@126.com)。

**通訊作者：梅書棋，研究員，研究方向：豬遺傳育種，(E-mail：msqlfe@163. com)。