利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本

鄭夏生， 賴智填，成金樂*　(.國家中醫藥管理局中藥破壁草本技術與應用重點研究室，中山市中智藥業集團有限公司，廣東中山 528437；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 00700)

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利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本

鄭夏生1，2， 賴智填1，成金樂1*(1.國家中醫藥管理局中藥破壁草本技術與應用重點研究室，中山市中智藥業集團有限公司，廣東中山 528437；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

摘要[目的]解決羅漢果和山藥破璧草本DNA提取困難，而無法用分子生物學鑒定的問題。[方法]通過比較常用DNA提取試劑盒法和改良的CTAB法，利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本。[結果]改良的CTAB法可從羅漢果和山藥的藥材、破壁粉末和破壁草本3種形態中成功地提取出基因組DNA，并可進一步利用DNA條形碼的psbA-trnH片段進行分子鑒定。[結論]該方法穩定可行，可用于羅漢果和山藥的藥材、破壁粉末和破壁草本的DNA條形碼鑒別。

關鍵詞羅漢果；山藥；破壁草本；DNA條形碼

Identification of Ultra-fine Granular Powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA bypsbA-trnHFragment

ZHENG Xia-sheng1,2,LAI Zhi-tian1,CHENG Jin-le1*

(1.The Key Laboratory of Technology of Breaking Cell Wall and Application in Chinese Medicine Decoction Pieces,Zhongshan Zhongzhi Pharmaceutical Group,Zhongshan,Guangdong 528437; 2.Institute of Chinese Materia Medica,Chinese Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700)

Abstract[Objective] To solve the problems of difficult extraction of DNA extraction from ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.[Method] Ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA were identified bypsbA-trnHfragment by comparing the traditional DNA extraction kit and improved CTAB method.[Result] The improved CTAB method could successfully extract the medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.psbA-trnHfragment in DNA barcode was used for molecular identification.[Conclusion] This method is stable and feasible,and can be used for the DNA barcode identification of medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.

Key wordsSIRAITIAE FRUCTUS; DIOSCOREAE RHIZOMA; Ultra-fine granular power of Chinese Herbal Medicine; DNA barcode

草晶華破壁草本由廣東省中藥破壁粉粒工程技術研究開發中心(依托中山市中智藥業集團有限公司)開發，是利用現代粉碎技術將傳統中藥飲片深加工成D90< 45 μm(300目以上)的粉體，再通過無固體添加成型技術制成的干燥顆粒狀飲片(30～100目)[1]。與傳統飲片相比，經過細胞破壁后破壁草本的有效物質溶出率更高[2-3]。破壁后藥材的顆粒粒徑非常小，失去了絕大多數的顯微特征，增加了其物種鑒定的難度。

DNA條形碼是通過基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的生物技術，具有快速、準確、重復性高等優點[4]。Chen等[5]通過對近萬份藥用植物樣本進行DNA條形碼篩選，提出一條藥用植物基因鑒定思路，即以ITS2作為標準DNA條形碼，以psbA-trnH作為輔助DNA條形碼[6]。DNA條形碼不僅可以從基因水平解決中藥材與混偽品的物種識別問題，同時也可用于建立中藥材二維DNA條形碼流通監管體系，為中藥材流通監管提供有力的技術支持[7]。

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitiagrosvenorii(Swingle.) C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang的干燥成熟果實。山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。筆者所在課題組前期研究發現這2個品種的藥材和破壁草本均無法按照常規的試驗方法進行DNA條形碼鑒別。原因可能是由于DNA提取困難，導致后續的PCR失敗。筆者利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本，克服了這2個品種的DNA提取困難，并成功進行后續的DNA條形碼鑒別。

1材料與方法

1.1試驗材料草晶華破壁草本均由中山市中智藥業集團有限公司提供，詳細信息見表1。中藥飲片經過破壁處理后得到破壁粉末，再被制備成破壁草本(圖1)。以上藥材由中山市中智藥業集團有限公司賈世清中藥師鑒定，憑證標本保存于國家中醫藥管理局中藥破壁飲片技術與應用重點研究室。

表1　樣品信息

1.2試驗方法

1.2.1樣品前處理。①傳統飲片：用滅菌的解剖刀切取約0.1 g，切碎，置于陶瓷研缽中，加入等量的PVP-40，用力研磨粉碎，稱取0.1 g用于DNA提取。②破壁粉末：直接稱取樣品50 mg用于DNA提取。③破壁草本：分別稱取各樣品50 mg，置于2.0 mL離心管中，加入2顆Φ 5 mm的滅菌鋼珠，用生物樣品均質儀(愛施德，Bioprep-24)以6.0 m/s 振蕩30 s，重復振蕩2次，每次間隔30 s，使樣品變成粉末狀，即可用于DNA提取。

1.2.2DNA提取。①試劑盒法：按照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克，DP3111)說明書操作。②改良CTAB法：向各樣品管中加入800 μL CTAB free緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，劇烈振蕩，旋轉混勻5 min，13 000 r/min離心3 min，棄上清液；重復該步驟1～2次。向各樣品管中加入800 μL CTAB緩沖液(3% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，充分振蕩混勻，65 ℃金屬浴中孵育3 h，期間每隔10 min左右顛倒混勻數下。加入600 μL氯仿-異戊醇(24∶1，V∶V)，充分振蕩混勻，靜置5 min，13 000 r/min離心15 min，小心吸取上清于新的1.5 mL離心管中。加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，-20 ℃放置10 min，13 000 r/min離心15 min，棄上清。加入800 μL -20 ℃預冷的75%乙醇，上下顛倒混勻數次，13 000 r/min離心15 min，重復1次。棄盡上清，打開離心管蓋子室溫晾干5 min，加入50 μL 65 ℃預熱的ddH2O，小心吹打沉淀，將可溶部分轉移至新的離心管中。取適量DNA用于質量檢測，其余的置于-20 ℃保存，備用。

1.2.3DNA質量檢測。取5 μL DNA，加45 μL ddH2O，混合均勻。以ddH2O為空白對照，用紫外分光光度計測定OD260和OD280，通過計算OD260/OD280評價DNA質量。

另取5 μL DNA，加1 μL 6 × DNA Loading buffer，混合均勻。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，評價DNA完整度。

1.2.4PCR擴增和測序。PCR反應體系：2 × PowerTaqPCR MasterMix(百泰克，PR1701)12.5 μL，正反向引物(psbA_F：GTTATGCATGAACGTAATGCTC，trnH_R：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應程序：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72 ℃，50 s，35個循環；72 ℃，5 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各PCR產物，目的區域出現清晰條帶的樣品則送樣測序。

圖1　試驗所用樣品Fig.1　Sample used in this research

1.3數據處理利用CodonCode Aligner(版本：5.1.5.0)分析測序所得的原始峰圖，拼接后去除低質量區和引物區。所得各樣品的DNA序列分別在NCBI上進行BLASTN；在中藥材DNA條形碼鑒定系統(http://www.tcmbarcode.cn/china/index.php optionid=174)上進行比對，取同源性(Identity)最高的比對結果。2結果與分析

2.1DNA質量2種方法提取得到的DNA，經紫外分光光度計檢測所得的吸光度比值見表2。由表2可知，試劑盒法提取的DNA質量較差，OD260/OD280均與理想值1.80～2.00相差較大；而改良CTAB法獲得的DNA質量較好，OD260/OD280與理想值1.80～2.00 相差較小。

從電泳結果看，試劑盒法未見明顯的DNA條帶；而改良的CTAB法則可以獲得清晰的DNA條帶(圖1)。綜合紫外分光光度值與電泳結果，說明改良的CTAB法更適合用于提取羅漢果和山藥的基因組DNA。

2.2序列比對結果PCR擴增后，改良CTAB法制備的樣品可獲得清晰的DNA條帶，而試劑盒法制備的樣品均為陰性(圖3)。將陽性樣品送檢測序，發現6個樣品均為陽性結果。說明改良的CTAB法用于提取羅漢果和山藥的基因組DNA是可靠的。

3種形態的羅漢果樣品經過PCR所得的psbA-trnH序列一致(均為173 bp)，與中藥材DNA條形碼鑒定系統和NCBI數據庫中羅漢果Siraitiagrosvenorii的序列(登錄號分別為：HAP00104和JN406966)同源性達100%(圖4A)；3種形態山藥樣品的psbA-trnH序列也是一致的(均為208 bp)，與中藥材DNA條形碼鑒定系統中山藥Dioscoreapolystachya的序列(登錄號：HAP00148)同源性達100%，與NCBI數據庫中山藥的序列(登錄號：JQ60354)同源性達99%(圖4B)。表明psbA-trnH可用于羅漢果和山藥中藥破壁草本的物種鑒定。

表2　2種方法提取得到的DNA吸光度

圖2　2種方法提取得到的DNA電泳結果Fig.2　Electrophoresis result of DNA extracted by two different methods

圖3　PCR結果Fig.3　PCR results

注：A.羅漢果，B.山藥。　Note：A was SIRAITIAE FRUCTUS and B was DIOSCOREAE RHIZOMA.圖4　序列比對結果Fig.4　Results of sequence alignment

3結論與討論

DNA條形碼用于中藥相關制品的物種鑒別，具有快速、高效的特點。該技術主要依靠對樣品DNA條形碼的成功擴增和測序，而前提是要獲得足夠量和達到一定純度的基因組DNA。DNA提取是一門相對成熟的技術，目前已有許多DNA提取試劑盒被開發出來，用于不同類型樣品的DNA提取。然而，這些試劑盒在植物DNA提取方面效果較差。因為植物種類紛繁復雜，且含有多酚和多糖等次生代謝產物，導致DNA提取困難甚至失敗。中藥材主要來源于植物，部分品種甚至經過高溫處理等炮制，更加重了DNA提取的困難。CTAB法是常用的DNA提取方法，許多學者以該方法為基礎，通過改良部分試驗環節或試劑以獲得適合于自身研究的物種[8-9]。

該研究采用的改良CTAB法主要有3處改進：①在藥材粉碎環節采用PVP-40與樣品一起研磨，一方面可以在未使用液氮的情況下增加樣品的可研磨性，另一方面PVP-40可以與樣品中的多酚、萜類物質起絡合作用及與多糖結合[10]，在裂解過程中將這些雜質除去。②采用CTAB free緩沖液預處理研磨后的樣品粉末[11]，除去色素等雜質。③將CTAB的濃度由2%提高至3%[12]，同時將裂解條件改進為65 ℃裂解3 h(試劑盒法為常溫裂解10 min)，加強對樣品細胞的裂解，以更大程度地獲取DNA。由此可知，該研究所用的改良CTAB法可以獲得純度較高、量較多的DNA。

中藥破壁草本是經過細胞破壁處理的一類新型飲片，由于失去絕大多數的細胞及組織顯微特征，造成物種鑒定困難。特別是部分中藥材，由于藥材經過炮制，或者藥材自身包含影響DNA提取的次生代謝產物，往往導致其DNA提取困難，而無法用于分子鑒定。DNA條形碼技術近年來在中藥鑒定方面的推廣，為破壁草本等粉末或顆粒狀中藥制品的物種鑒定提供了技術參考。

參考文獻

[1] 成金樂,賴智填,彭麗華.中藥破壁飲片研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2014(2)：254-262.

[3] 徐浩淇,陳莎,章軍,等.西洋參破壁飲片、粗粉與傳統飲片中人參皂苷的體外溶出度比較[J].中國中藥雜志,2015(13)：2576-2581.

[4] 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列[M].北京：科學出版社,2015:3.

[5] CHEN S,YAO H,HAN J,et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One,2010,1 (5):8613.

[6] 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[J].中國中藥雜志,2013(2)：141-148.

[7] 辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維DNA條形碼流通監管體系研究[J].中國科學:生命科學,2015(7)：695-702.

[8] 鄭泉,郭維明,鄭勇平,等.“頑拗”植物春石斛基因組DNA的提取研究[J].安徽農業科學,2010(3)：1156-1159,1166.

[9] 郭凌飛,鄒明宏,曾輝,等.頑拗植物澳洲堅果成熟葉片DNA提取方法比較[J].生物技術,2008(1)：45-47.

[10] 段中崗,黃瓊林，楊錦芬,等.適合中藥材DNA條形碼分析的DNA提取方法的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2009(5)：480-484.

[11] 丁芳兵,劉連芬,湯庚國,等.從蘋果屬臘葉標本中提取DNA的改良CTAB法研究[J].中國農學通報,2012(16):176-179.

[12] 宋艷波,吳國良牛，洪斌.改良CTAB法在核桃葉片基因組DNA提取中的應用研究[J].山西農業大學學報(自然科學版),2011(2):109-112.

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)06-163-04

收稿日期2016-01-22

作者簡介鄭夏生(1987- )，男，廣東揭陽人，博士，從事藥用植物分子生物學研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事中藥質量研究。