HPLC法測定不同產地黃芪中芒柄花苷的含量

禹亞杰，彭騰，尚寧寧，李鴻翔

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HPLC法測定不同產地黃芪中芒柄花苷的含量

禹亞杰，彭騰，尚寧寧，李鴻翔

[摘要]目的：測定十批不同產地黃芪藥材中芒柄花苷的含量，用以評價不同產地的黃芪的質量，為實際生產和臨床應用黃芪藥材的選擇提供參考。方法：采用80％甲醇回流提取，反相高效液相色譜法進行測定。Diamonsil鉆石C(18)色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈：水=25：75等度洗脫；流速：1ml．min(-1)；柱溫：30℃；檢測波長254nm。結果：內蒙古和山西產的黃芪中芒柄花苷的含量較甘肅與長春高。結論：不同產地的黃芪中芒柄花苷的含量差異較大，同一產地黃芪中的芒柄花苷的含量也存在差異。

[關鍵詞]黃芪；芒柄花苷；HPLC；含量測定

[作者單位]成都中醫藥大學，四川 成都 611137

黃芪為常見的中草藥也是臨床常用的中藥之一。黃芪(Astragalus, AS)是豆科植物蒙古黃芪 Astragalus mem-branaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或 膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。芒柄花苷是中藥黃芪、甘草、葛根等藥材中黃酮類化合物的主要成分之一。具有促進皮膚生長、抑制脂質過氧化、清除氧自由基、抑制脂質過氧化、維持血中 NO濃度等多種藥理活性。芒柄花苷還具有促進人體腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌生長和抑制腸球菌和腸桿菌生長的作用[2]。本實驗在相同條件下測定十批不同產地黃芪中芒柄花苷的含量，為評價不同產地的黃芪的質量以及臨床與生產用藥的篩選提供參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20AT），DAD檢測器；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；BP121S型電子天平（德國Sartorius公司）；優普UPT系列超純水器（成都優普電子產品有限公司）色譜柱：Diamonsil鉆石C18（250mm×4.6mm，5μm）

1.2試劑

色譜乙腈和甲醇（美國天地）、超純水、其他試劑均為分析純。

1.3對照品

芒柄花苷（自制，HPLC檢測純度＞98％）。

1.4藥材

黃芪（十批藥材的產地與購入時間見表1），由成都中醫藥大學中藥鑒定教研室龍飛副教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》的要求。

表1　十批黃芪藥材的產地與購入時間

2　方法與結果

2.1對照品制備

精密稱取芒柄花苷對照品0.00202g，甲醇定容至10ml，得濃度為0.202mg．ml-1的對照品溶液備用。

2.2色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀，DAD檢測器；色譜柱：Diamonsil鉆石C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈：水=25：75；流速：1ml．min-1；柱溫：30℃；檢測波長254nm。芒柄花苷對照品與黃芪樣品的色譜圖見圖1。

圖1　黃芪樣品及對照品HPLC色譜圖

3　實驗結果

3.1線性關系考察

取“2.1”項下對照品采用自動進樣法分別進樣4,8,12,16,20μL，以“2.2”項下的色譜條件進行測定記錄峰面積。以芒柄花苷的進樣量（μg）為自變量X，峰面積Y為因變量，作標準曲線。見圖2。芒柄花苷的標準曲線為Y=3E+0.6X，r=0.9999，表明進樣量在0.802～4.04μg之間線性關系良好。

圖2　芒柄花苷標準曲線

3.2精密度考察

取“2.1”項下對照品溶液連續進樣6次，每次10μL，計算芒柄花苷峰面積的RSD值為0.56％，表明精密度良好。

3.3重復性考察

取同一供試品連續進樣6次，計算芒柄花苷的峰面積的RSD為0.63％，表明重復性良好。

3.4穩定性考察

取同一供試品分別在0、2、4、8、16、24h進樣10μL，計算峰面積的RSD為1.38％，表明樣品在24h內穩定性良好。

3.5加樣回收實驗

取已知含量的樣品5g，按樣品含量的50％、100％、150％加入芒柄花苷對照品，每個濃度平行3份，共 9份樣品。按供試品溶液制備項下方法制備供試品，以“2.3”項下色譜條件進行測定，計算回收率,芒柄花苷的平均回收率分別為99.52％、100.36％、100.57％，RSD分別為2.32％、1.04％、2.66％＜3％。表明該方法的準確度良好。具體數據及結果見表2。

表2　加樣回收實驗結果（n=9）

3.6十批黃芪樣品制備及含量測定

精密稱取各產地黃芪藥材粗粉3份，每份10.00g，加入250ml80％乙醇80℃回流提取兩次，每次1h，過濾減壓回收溶劑甲醇定容至10ml。用0.45μm微孔濾膜過濾后按“2.2”項下液相條件進行測定，分別進樣10μL，記錄峰面積，用外標一點法計算含量。具體結果見表3。

表3　十批黃芪中芒柄花苷含量（n=3）

4　討論

目前對不同產地、用藥部位、年限、品種的單味藥中黃酮類成分的分離，制備以及含量測定均有比較全面的研究[3～6]，但不同產地的黃芪中芒柄花苷含量測定的報道較少。

從實驗結果可以看出內蒙古和山西產的黃芪中的芒柄花苷的含量較高，同一產區內的黃芪樣品中芒柄花苷的含量也有所差異。由于產地、采收加工、時間等都可能成為影響芒柄花苷含量的因素，本實驗的取樣量較少，不能較為全面的評價黃芪藥材的質量，僅對芒柄花苷在不同地區的黃芪中的含量分布做一個參考，對于同一產地不同區域以及不同采收時間的黃芪中芒柄花苷的含量還需要進一步研究。

本實驗還對HPLC-DAD測定芒柄花苷的液相條件進行了考察，分別考察了不同比例的流動相（甲醇-水和乙腈-水）、流速、柱溫以及檢測波長。通過對出峰時間、峰的對稱性以及樣品中峰的分離度等條件的綜合考慮，最終選擇了乙腈：水=25∶75；流速：1ml．min-1；柱溫：30℃；檢測波長254nm的液相條件。

在測定不同產地黃芪中芒柄花苷含量的同時，也對黃芪同科植物甘草和葛根中的芒柄花苷的含量[7～8]進行了測定，發現黃芪中芒柄花苷的含量在同科植物中并不是最高的，對于芒柄花苷在同科不同植物中的分布需要進一步研究。

[參考文獻]

[1]國家藥典委員會.《中國藥典》一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:283.

[2]張蔚,江曙,錢大瑋,等.芒柄花苷與人體腸道細菌的相互作用研究[J].藥學學報,2014,08:1162.

[3]付娟,楊世海,黃林芳.超高效液相色譜法同時測定黃芪中6種黃酮類成分的含量[J].中國藥學雜志,2013,11:916.

[4]王祖林,韓利文,劉秀河,等.高速逆流色譜法分離制備甘草中的芒柄花苷[J].山東科學,2010,02:18.

[5]程霞,肖朝江,孫俊哲,等.長小苞黃芪化學成分研究[J].大理學院學報,2014,02:3.

[6]季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黃酮的研究進展[J].中草藥, 2004,09:126.

[7]劉育辰,陳有根,王丹,等.甘草化學成分研究[J].藥物分析雜志,2011,07:1251.

[8]王治平,李衛民,高英,等.HPLC同時測定不同產地葛根中6種主要異黃酮類成分的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013,08:125.

（責任編輯：胡慧玲）

Content determination of Ononin in Huangqi from different producing areas by HPLC

YU Ya-jie, PENG Teng, SHANG Ning-ning, LI Hong-xiang
(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137,Sichuan)

[Abstract]Objective: The Ononin content in 10 batches of Huangqi from different producing areas were detected to evaluate the quality of Huangqi from different producing areas and provide reference for the selection of Huangqi in production and clinical application.Method: Ononin was extracted using 80％ methanol reflux extraction.HPLC analysis was performed to detect Ononin content.The analysis was carried out on a DiamonsilC(18)(250m×4.6mm, 5μm)column with a mobile phases (acetonitrile : water = 25:75) .The column temperature was 30℃.The flow rate was 1mL．min(-1)and the detection was set at 254nm.Result: Ononin content in Huangqi from Inner Monglia and Shanxi were higher than Gansu and Changchun.Conclusion: Difference can be found in Ononin content in Huangqi from different producing areas.And Ononin content is different in Huangqi from the same producing area.

[Key words]Huangqi; Ononin; HPLC; content determination

[收稿日期]2015-07-13

[通訊作者]彭騰，副教授，碩士生導師，從事中藥藥效物質基礎及質量標準研究Tel:13880376673Email:pengteng1973@sina.com

[作者簡介]禹亞杰，女，碩士在讀，從事中藥有效成分物質基礎及質量標準研究工作Email:yuyajie201307@163.com

[基金項目]四川省教育廳重點項目資助課題(10ZA095)；成都市科技攻關項目資助課題(12GGYB346SW-001)

[中圖分類號]R282.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-926X(2016)01-006-03