中國實驗用小型豬生化標記檢測研究

邵明英　王　皓　葛長利　陳其美　董　彬李訓碧

（1海南職業技術學院，海南海口570000；2中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193；3山東藍思種業股份有限公司，山東日照276800；4全國畜牧總站，北京100124）

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中國實驗用小型豬生化標記檢測研究

邵明英1,2*王皓2,4*葛長利3陳其美3董彬3李訓碧2#

（1海南職業技術學院，海南海口570000；2中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193；3山東藍思種業股份有限公司，山東日照276800；4全國畜牧總站，北京100124）

摘要：本試驗采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法，對我國實驗用小型豬生化標記實行相應的探究。收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬和山東萊蕪豬等的血液樣品，檢測了不同品種豬堿性磷酸酶（APK）、轉鐵蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）、乙醇脫氫酶（ADH3）、醛縮酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脫氫酶（GLD）等9個生化標記位點。結果顯示：所檢測的4個品種豬、9個生化標記位點中的ADH3、GLD、ALDA三個位點電泳呈現單條帶，不存在多態性；其他6個位點都存在多態性。此外，還發現G6PD和Ca兩個位點在五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬品種和山東萊蕪豬中表現型有明顯不同。經對所統計數據與結果進行相應的分析與總結，確定了4個類型豬的遺傳性變異、體系構造及種類之間的遺傳聯系等；并從此方向揭示了我國現存實驗用小型豬的遺傳多樣性情況，豐富了我國地方豬種遺傳資源數據庫。

關鍵詞：實驗用小型豬；遺傳多樣性；生化標記；聚丙烯酰胺凝膠電泳；檢測

我國具有豐富的豬種質資源，同時擁有獨特而又豐富的小型豬資源[1,2]。小型豬的應用前景非常廣闊，尤其是在比較醫學領域：實驗用小型豬以其來源清楚、體型小、耐近交、遺傳穩定及遺傳背景明確等獨特優勢，以及在心血管組織、消化組織、皮膚組織、骨組織生長、營養攝取、新陳代謝以及解剖結構等環節和人體比較相像，已逐漸成為醫學研究中一種重要的動物模型[3,4]。

自20世紀80年代以來，我國已開始對小型豬資源的多領域開展研究，包括近交系培育、分子遺傳學基礎、生長發育規律、飼料營養代謝、血液生理生化指標、組織器官生理解剖、比較醫學生物安全性及開發應用等[5-7]。基于我國地形、生態條件的多樣性，我國小型豬品種在經過歷代人工和自然選擇后，已具有得天獨厚的資源和條件。我國小型豬主要的品種有：海南五指山小型豬、云南小耳豬、貴州香豬、廣西巴馬香豬、甘肅合作豬、滇南小耳豬、烏金豬、青海藏豬等。盡管全球小型豬資源主要集中在中國和越南，但缺乏符合國際標準的實驗用豬，已成為制約小型豬及其生物制品開發應用的主要因素。

生化標記是根據動物機體的生理情況作為遺傳標記，基本上包含血型、血清蛋白以及同工酶等多個方面，是當前四大主要遺傳標記之一。通過對動物體內蛋白、同工酶等的檢測，評價動物品種內的遺傳變異和品種間的親緣關系。血液蛋白多態性（Protein Polymorphism）是一種常用的生化遺傳標記，表示的是具備某一特定性能的血液蛋白質或者酶具有兩種以上的遺傳變異體[8]。

電泳是生化標記檢測最常用的方法[9]，根據支持物不同可分為：紙電泳與凝膠電泳。聚丙烯酰氨凝膠電泳方式是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用方法，它具備以下特點：⑴當濃度含量達到一定程度時，凝膠呈現透明狀，彈性效果較佳，機械功能較好；⑵同被分離物質不會產生相應的化學效果；⑶對pH值以及溫度的范圍較為穩固；⑷從大體上來看，基本不具有電滲效果，在濃度含量較高、操作流程相同的條件下，其樣品的分離重復性較好；⑸樣品極不容易進行分散，且使用的數量較少，靈敏程度能夠達到1 μg；⑹凝膠的孔徑可以進行調整，并可依照被分離物質的分子量選取與其相適應的濃度指標；⑺分辨率高。

本試驗采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法，對中國實驗用小型豬生化標記進行研究。收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬以及山東萊蕪豬等4個品種豬的血液當做樣本，檢測了不同品種豬的9個生化標記位點。本研究的開展將為我國矮小型豬種質資源挖掘和保護提供基礎，為小型豬近交系的建立提供有力的參考依據，并促進試驗用小型豬生化標記檢測方法標準的制定。

1　材料與方法

1.1采樣及樣品的分離方法

使用前腔靜脈采血法，收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬以及山東萊蕪豬等4個品種豬的血液當做樣本（表1）。

表1　采樣品種及數量　（頭）

每頭豬采集血液10mL，肝素鈉抗凝（肝素為100U/mL全血），在4℃的條件下，以1 000轉/分鐘的速度離心10分鐘，并在此之后，獲取上層的血漿。把下層血細胞進行洗滌，并以1 000轉/分鐘的速度進行離心，持續時間為10分鐘，將上層液體除去，并再次進行洗滌。以上血漿與溶血液均保存在-20℃冰箱中備用。

1.2標記位點電泳檢測試驗

本試驗采用垂直板聚丙烯酰氨凝膠電泳法檢測了不同品種豬堿性磷酸酶（APK）、轉鐵蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）、乙醇脫氫酶（ADH3）、醛縮酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脫氫酶（GLD）等9個生化標記位點。凝膠濃度、緩沖液系統和相關電泳條件詳見表2。

表2　凝膠濃度含量，緩沖液結構以及有關的電泳條件

1.3數據分析

應用生物學軟件Mega3.1研究系統發生樹，用GENEPOP估算等位基因頻率等群體遺傳學參數，用PIC統計工具進行多態性信息含量、位點雜合度等，用DISPAN軟件包計算遺傳分化系數、總群里雜合度、亞群體雜合度和遺傳距離等。

2　結果與分析

2.1生化標記功能分析

本研究遵循下述幾項規定選取了9個待測定的生化標記位點（表3）：參考在豬種類中和別的實驗型生物中已經存在的生化標記位點；綜合考察備選位點在染色體的分布，盡可能涵蓋全部染色體，以其代表該品種動物的特點。

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）是目前免疫診斷試劑產品最常用的標記酶之一，具有穩定性高、靈敏度高等優點。作為一種非特異性磷酸單酯酶，AKP能催化磷酸單酯的水解反應和磷酸基團的轉移反應[10]。

轉鐵蛋白（Transferrin,Tf）又稱運鐵蛋白，是血漿中β球蛋白與鐵結合蛋白的一種復合物，最早是從豬的血清中提取。一個轉鐵蛋白分子可以和兩個Fe3+進行融合，并把Fe傳遞至骨髓中，對血紅蛋白的形成起到一定的促進作用。除此之外，轉鐵蛋白還可以起到抗微生物的效果，并因其具有多種分子體系，所以在進行電泳之后，呈現出的區帶也是多樣化的[11]。

蛋白抑止物（Protease inhibitor,Pi-1），主要功能是中和由白細胞、肝臟和細菌釋放出來的蛋白酶[12]。

后白蛋白（Postalbumin,Po-2）又稱清蛋白，是血漿中含量最高的蛋白質，主要作用是維持血漿中膠體的滲透壓。后白蛋白主要由肝臟合成，Po-2的濃度含量能夠體現出肝臟組織的主要性能，其濃度的變化可以引發相應的繼發癥狀。對血清后白蛋白的檢測已廣泛應用于生化標記監測[12]。

葡萄糖6磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogen ase,G6PD）存在于機體的血紅細胞中，并幫助葡萄糖進行機體代謝，在此環節中將會生成NADPH，進而避免血紅細胞受到氧化組織的侵害。G6PD可以協助血紅細胞正常運行，保護血紅細胞抵抗物質的積聚[13]。

乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase3,ADH3）基本上則是在肝臟部位產生，因此肝臟組織所患有的疾病或許同血清ADH活性存在密切的聯系。采用分光光度方式對血清內ADH的活性進行評測，并且對這一指標進行深入的探討，研究出其在疾病治療過程中所起的作用。通過血清ADH活性測定，可以明確肝臟組織的各項功能是否存在問題。在對患有肝臟疾病患者血清內的ADH進行檢測時我們可觀察到，最終結果顯著高于普通人群[14]。

谷氨酸脫氫酶（Glutamic acid dehydrogenase,GLDH）是眾多線粒體酶中的一類，其中含有部分鋅元素，該酶在人體內的分布具有一定規律，多出現在肝臟、心肌以及腎細胞中，其中，肝細胞中的GLDH活性最高，它催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應[15]。

醛縮酶（Aldolase,ALD）通常是指糖酵解途徑中的1,6-二磷酸果糖醛縮酶，是Meyerhof等于1936年首先發現的。自1950年起，有關人員對哺乳動物細胞中的醛縮酶進行了持續的探究，結果發現動物體內共存在三類不同的ALD同工酶。血清ALD增高主要用于診斷肌肉和肝臟疾病，也可能是體內某些組織或器官發生病變所致。每個細胞中存在的ALD同工酶都具備其各自不同的獨特性質，因此檢測血清中的ALD同工酶能夠有效增強細胞的獨特性質，從而可以相對精準地找出發生病變反應的區域，及該區域發生病變反應的嚴重程度[16]。

表3　生化標記位點

碳酸酐酶（Carbonic anhydrase,Ca）屬于金屬酶的范疇，其中含有一定量的鋅元素，這種酶的組成結構有一個重要特性，即在它的活性區域存在一種特殊的鋅原子，且該鋅原子是其發揮催化效應的必備元素。這種酶的催化機理為：促進二氧化碳進行水和反應，且該反應在一定條件下可逆，繼而減少二氧化碳在植物葉肉組織中的流通障礙，有效推動二氧化碳向Rubi-sco的進一步流通，從而保證植物體內的羧化反應能夠具備充足的反應物質。許多生物反應都涉及到了碳酸酐酶的催化作用，其中主要有pH調節、離子轉換、CO2運輸、呼吸作用及光合作用中的二氧化碳固定等[17]。

2.2生化位點遺傳變化和遺傳學差異

根據GENEPOP軟件工具，對樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份的生化位點出現頻率進行統計（表4）。

表4　不同豬種生化位點的發生頻率

2.3不同品種豬的遺傳多樣性信息

根據生物學軟件pic統計工具，對樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份的有效等位基因數（Ne）、多態信息含量（PIC）以及平均雜合度進行統計（表5）。

表5　四個品種的有效等位基因數、多態信息含量和雜合度

根據生物學軟件GENEPOP和PIC統計工具，對樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份進行統計，得出不同豬品種的遺傳多樣性信息（表6）。

根據生物學軟件DISPAN，對樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份得出4個品種豬的遺傳距離（表7）。

3　討論

3.1生化標記位點多態性

本文針對4個不同種類豬的9個生化標記位點進行了探究，詳細敘述了中國4個不同區域性種類豬的遺傳構型與遺傳變異。探究成果顯示，試驗測定的9個生化標記位點中的ADH3、GLD、ALDA等3個位點電泳呈現單條帶，不存在多態性；其他6個位點都存在多態性。此外，還發現G6PD和Ca兩個位點在五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬品種和一個普通豬品種山東萊蕪豬中表現型有明顯不同（表4）。

Pi-1有2種基因型，且呈多態性，不同品種豬的Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率有差異，在山東萊蕪豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.41666和0.58333，Pi-1B為優勢基因；在貴州小型豬中Pi-1A 和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.41666和0.58333，Pi-1B為優勢基因；在五指山小型豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.82558和0.17441，Pi-1A為優勢基因；在巴馬小型豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.77083和0.22916，Pi-1A為優勢基因。

表6　遺傳多樣性信息

表7　4個品種豬的遺傳距離

Po-2有2種基因型，且呈多態性，在山東萊蕪豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.57142和0.4257，Po-2A為優勢基因；在貴州小型豬中Po-2A 和Po-2B等位基因的頻率分別為0.15909和0.84090，Po-2B為優勢基因；在五指山小型豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.77906和0.22093，Po-2A為優勢基因；在巴馬小型豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.94444和0.05555，Po-2A為優勢基因。

Tf有多種基因型，且呈多態性[18]，在山東萊蕪豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.26744、0.65476、0.05952和0.01190，TfB為優勢基因；在貴州小型豬中，TfA和TfB等位基因的頻率分別為0.32222和0.67045，TfB為優勢基因；在五指山小型豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.29545、0.32558、0.16279和0.20930，TfB為優勢基因；在巴馬小型豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.28767、0.59722、0.06250和0.04861，TfB為優勢基因。

AKP有2種基因型，且呈多態性，不同品種豬的AKPA和AKPB等位基因的頻率有差異，在山東萊蕪豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.13095和0.86904，AKPB為優勢基因；在貴州小型豬中，AKPA 和AKPB等位基因的頻率分別為0.04545和0.95454，AKPB為優勢基因；在五指山小型豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.09302和0.90697，AKPB為優勢基因；在巴馬小型豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.10416和0.89583，AKPB為優勢基因。

G6PD和Ca的分析同上。

3.2遺傳多樣性

已有研究表明，用于測量遺傳變化的生化標記在種群內的平均雜合度需要維持在0.3～0.8的范疇內，否則就不具備一定的實踐價值[19]。在該探究中生化標記在4個中國地方豬品種的平均雜合度維持在0.36～0.54的范疇內（表6），所以該探究運用采用的生化標記，能夠有效適用于檢測生物遺傳多樣化的相關研究中。

3.3遺傳距離

遺傳距離能夠在一定程度上顯示不同種類或者不同品系間親緣關系的遠近。按照有關遺傳距離計算標準得到的規范距離為從0.0223～0.1112不等（表7），其中兩品種間距離最近的是廣西巴馬小型豬和五指山小型豬（0.0223），五指山小型豬與貴州小型豬距離最遠（0.1112）。

4　結論

動物生化標記是家畜遺傳變異的直接反映。生化標記多樣化和生物經濟性狀在遺傳上具有一定的聯系，且在理論上通常體現為3類不同的形式。除此之外，生化標記多樣化不僅在理論上具有前瞻性的引導價值，在經濟生產方面還存在一定的實際意義，能夠適用于對生物種類的初期篩選及相關遺傳育種工作，從而可有效推動我國遺傳育種的發展進程。

本研究挑選了三個用于我國試驗探究的小型豬品種，以及一個區域性品種豬的9個生化標記位點作為探究對象，并對其實行有效測定，通過蛋白凝膠電泳梯度檢測了不同品種豬生化標記位點。通過生化標記檢測成果的統計剖析及聚類，確定了4個不同種類豬的遺傳變異、種群構型及不同種類間的親緣關系。從生化標記多樣化著手，深刻闡述了我國目前存在的小型品種豬的遺傳多樣化狀況，豐富了我國地方豬種遺傳資源數據庫。

參考文獻

[1]Weimin Z,Yulian M,Lei M,et al.Systematic identification and characterization of long intergenic non-coding RNAs in fetal porcine skeletal muscle development[J].Sci Rep,2015(5):8957.

[2]Tang Z,Li Y,Wan P,et al.LongSAGE analysis of skeletal muscle at three prenatal stages in Tongcheng and Landrace pigs [J].Genome Biol,2007,8(6):R115.

[3]Ross JW,Fernandez de Castro JP,Zhao J,et al.Generation of an inbred miniature pig model of retinitis pigmentosa[J].IOVS,2012,53(1):501-507.

[4]馮媛媛,白雪源,賀津,等.中國實驗用小型豬血液指標正常參考值分析[J].中國畜牧獸醫，2013,40(6):139-141.

[5]馮書堂,牟玉蓮,張莉,等.五指山豬種質特性及開發利用研究[J].豬業科學,2006 (5):78-81.

[6]馮書堂.遺傳資源創新是我國地方豬種保存和利用的重要途徑——記我國近交系小型豬培育、利用20年[J].豬業科學,2010(1): 106-110.

[7]馮書堂，李奎，牟玉蓮，等.五指山小型豬近交系培育與遺傳資源創新[J].農業生物技術學報,2012,20(8):849-857.

[8]吳譯夫.豬血清蛋白質多態型的電泳測定法[J].上海畜牧獸醫通訊,1988(1):8-9.

[9]帥素容,肖永祚.四川豬血清Tf、Am1、Am2多態性及六種生化指標的分析研究[A].見:第六次全國畜禽遺傳育種學術討論會論文集[C].1991: 243-249.

[10]王秋穎.堿性磷酸酶特性及其應用的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2011(1):157-161.

[11]陶鈞，鄒峰.湖南地方豬種群親緣關系的生化遺傳學研究[J].畜牧獸醫學報，1992,23(1):13-21.

[12]符亞原.四個瘦肉型豬品種(品系)血清蛋白多態性的研究[D].太谷:山西農業大學,2004.

[13]唐娟,譚毅.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥檢測方法的研究進展[J].中國臨床新醫學,2015,8(1):92-96.

[14]鮑文娜.乙醇脫氫酶的克隆表達及生物活性分析[D].杭州:浙江大學,2007.

[15]朱鴻,李想韻,王松,等.鴨肝谷氨酸脫氫酶的純化與酶學性質研究[J].食品科學,2010,31(19):231-235.

[16]管凱年.醛縮酶A和CK19在綿羊肺腺瘤中的表達研究[D].呼和浩特:內蒙古農業大學,2014.

[17]吳沿友,李西騰,郝建朝,等.不同植物的碳酸酐酶活力差異研究[J].廣西植物,2006,26(4):366-369.

[18].盧福山，樊平.仔豬血清運鐵蛋白多態性及其與生產性能的相關性分析[J].安徽農業科學,2014(1):128-129.

[19]Takezaki N,Neim M.Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA [J].Genetics,1996,144(1):389-399.

#通訊作者：李訓碧，助理研究員，E-mail:lixunbi0214@163.com

作者簡介：邵明英(1976-)，女，河北人，畜牧師，主要從事畜牧獸醫專業教學及科研工作；E-mail: mingshao2013@aliyun.com，Tel：0898-31930606

基金項目：中國農業科學院科技創新工程"（ASTIP-IAS05）；山東省泰山學者種業計劃項目，863計劃項目（2013AA102502）

收稿日期：2015-08-28

中圖分類號：S828.8+9

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4645(2016)02-0055-06

*共同第一作者：王皓（1981-），男，山東人，畜牧師，從事種畜禽遺傳改良和生產經營管理工作，E-mail:2712wanghao@163.com，Tel：010-59194610