四特酒大曲中枯草芽孢桿菌的益生特性研究

嚴美婷，李海閩，張超鳳，杜　霞，張鳳英（江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

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四特酒大曲中枯草芽孢桿菌的益生特性研究

嚴美婷，李海閩，張超鳳，杜霞，張鳳英
（江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

摘要：在四特酒大曲中分離純化出4株細菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌。通過采用體外模擬動物胃腸道環境的方法，對該4株枯草芽孢桿菌的益生特性（對酸、膽鹽的耐受性及抑菌效果和產酶特性）進行研究。結果表明，其中有2株枯草芽孢桿菌具有較強的耐酸和耐膽鹽能力，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，分解淀粉酶和蛋白酶的能力也較高。因此，可判斷這兩株枯草芽孢桿菌具有較好的益生特性。

關鍵詞：四特酒曲；枯草芽孢桿菌；益生特性

近年來，由于抗生素的過度使用，從而使得很多細菌產生了耐藥性。而益生菌具有提高人體和動物免疫力、降低血脂、促進人體對營養物質的吸收、預防和治療腹瀉及便秘、抑制腸道病原菌及腐敗微生物的生長、分解致癌物質等作用[1]。

其中枯草芽孢桿菌可以作為很好的益生菌菌種，它是農業部公布的16種可直接飼喂動物的飼料級益生菌菌種之一[2]。它能在動物腸道中生長，促進腸道內正常菌群的繁殖及抑制致病菌，其代謝產物能調節宿主腸道內微生物的平衡，且對宿主有益、無毒性、無致病作用[3]。

隨著生物技術的快速發展，微生態制劑已成為熱門研發課題，它已應用于農業、醫藥保健、飼料和食品等各領域中。我國農業部在2003年公布了十幾種能用于生產微生態制劑的菌種，主要有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞鏈球菌和酵母[4]。

目前，絕大多數益生菌菌株都是從動物腸道中獲得，少數從自然界中分離得到，其實大曲中有益微生物種源非常豐富，但從中國酒曲中分離益生菌的報道卻很少。因此本實驗試圖從四特酒大曲中分離獲取到有用的益生菌；分離到菌株后再采用體外模擬動物胃腸道環境，探討其益生特性，即耐酸性、耐膽鹽能力、產酶特性及對常見病原菌的抑制作用[5-6]，從而初步判斷其能否作為益生菌，為以后生產微生態制劑提供了一定的科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

菌株：枯草芽孢桿菌T1、T2、T3、T4由四特酒大曲中分離純化而來；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由江西農業大學食品微生物實驗室提供。

試劑：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、酪蛋白、三號膽鹽均為生化試劑；磷酸氫二鈉、氯化鈉、葡萄糖、可溶性淀粉均為分析純。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（營養瓊脂培養基）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂15～17 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.4，0.1 MPa滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨液體培養基無需加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH值自然，0.1 MPa滅菌20 min。

淀粉瓊脂培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂15 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，pH7.2，0.1 MPa滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養基[7]：牛肉膏3 g/L，酪蛋白10 g/L，瓊脂2 %，NaCl 5 g/L，將pH值調成7.4后，再加入磷酸二氫鈉2 g，0.4 %溴麝香草酚藍溶液12.5 mL。

豬膽鹽培養基：牛肉膏蛋白胨液體培養基中加入0.3 %（w/v）的膽鹽，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2實驗方法

1.2.1耐酸性測定

取適量10 %左右的鹽酸，分別用蒸餾水將pH值調為2.0、3.0、4 .0，制成人工胃液，121℃、0.1 MPa滅菌15 min，冷卻備用。將分離純化得到的4株枯草芽孢桿菌T1、T2、T3、T4活化并制成細菌含量為1.92×109cfu/mL的菌懸液，然后各以10 %的接種量接于不同pH值的人工胃液中，37℃下180 r/min進行搖瓶培養，分別在0 h、1 h、2 h、2.5 h取出相應的菌液進行平板菌落計數，測定其活菌數和存活率。

1.2.2膽鹽耐受性測定

將4株枯草芽孢桿菌制成細菌含量1.79×109cfu/mL的菌懸液后，各以10 %的接種量接入已配好的豬膽鹽培養基中，37℃下180 r/min進行搖瓶培養，分別于0 h、1 h、2 h、2.5 h取出相應的菌液，進行平板菌落計數，測定其活菌數并計算存活率。

1.2.3抑菌試驗

將活化培養的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌制成細菌含量分別為1.8×108cfu/mL和1.2×108cfu/mL的菌懸液。然后將制備好的致病菌菌懸液各自稀釋10倍、100倍和1000倍，再分別取0.2 mL菌液于培養皿中，倒入培養基混勻，待其凝固后立即分別將4株枯草芽孢桿菌點種于平板中（接入極少量即可）進行抑菌實驗，待其培養24 h后觀察抑菌圈大小并測量其直徑。

1.2.4產酶特性試驗

將T1、T2、T3、T4分別點種于淀粉瓊脂培養基、酪蛋白瓊脂培養基平板上，放入恒溫箱培養24 h后，觀察并測定其水解圈直徑(J)和菌落直徑(K)的大小，計算出J/K比值。

將T1、T2、T3、T4分別接入麩皮中培養48 h，然后將其倒入已滅菌的信封中烘干備用。稱10 g米粉加入100 mL水，將其在熱水浴中蒸成糊狀，然后稱0.5 g樣品放入其中攪勻，一段時間后觀察其液化能力。

1.3數據分析

用DPS v6.55版統計軟件對實驗所得數據進行分析處理，采用新復極差分析法對各組數據進行多重比較。

2　結果與分析

2.1耐酸性研究

動物的胃中含有較多的胃酸，其pH值范圍為2.6～5.83[8]，要想讓益生菌在動物體內發揮作用，就必須保證其在到達腸胃的過程中不被動物體內的胃酸環境所殺死。因此選擇益生菌時首先要考慮菌株是否具有較強的耐酸性，是否能夠耐受胃液，以較高的存活率到達腸內。4株枯草芽孢桿菌在不同pH值情況下，與人工胃液作用不同時間后，所測得的活菌數及存活率見表1、表2。

表1　不同pH值處理對枯草芽孢桿菌活菌數的影響(lg cfu/mL)

表2　不同pH值處理對枯草芽孢桿菌存活率的影響　(%)

由表1可知，T1在pH值為2.0～4.0的人工胃液中，其活菌數無明顯差異（P＜0.05），而T2、T3、T4這3株菌的活菌數都差異顯著，它們的活菌數都隨著pH值的降低而降低。并且這4株菌的活菌數隨著培養時間的增加而顯著降低（P＜0.05）。表2顯示T1菌在pH值為2.0的人工胃液中培養2.5 h后其存活率較高，達到了31.74%，T3的存活率也達到了25.39 %，因此說明T1和T3具有耐酸性。而T2和T4在各pH值下培養2.5 h后其存活率分別只在8.70 %～21.83 %和2.45 %～21.07 %之間，由此說明T2和T4與T1、T3這2株菌相比耐酸性較差。

2.2膽鹽耐受性研究

消化道中分泌的膽汁是益生菌發揮作用的另一個障礙，人體及動物十二指腸內食糜中膽汁鹽含量在0.03 %～0.3 %之間[9]，要想讓益生菌在消化道內高效地發揮作用，其菌體就必須能耐受0.3 %(w/v)的膽鹽環境，益生菌才能在通過胃進入腸道后還能保持足夠的活菌數，從而發揮調節微生態平衡的作用。4株枯草芽孢桿菌在0 h、1 h、2 h、2.5 h內對0.3 %(w/v)豬膽鹽的耐受性結果見表3、圖1。

表3　膽鹽對枯草芽孢桿菌活菌數的影響　(lg cfu/mL)

圖1　膽鹽對枯草芽孢桿菌存活率的影響

由表3、圖1可看出，隨著培養時間的增加，4株菌的活菌數都在下降，特別是T2和T4，膽鹽對它們的影響很大，在培養2.5 h后，它們的活菌率分別只有8.68 %和6.02 %。而T1及T3菌卻不同，它們在培養2.5 h后，活菌數仍在107cfu/mL以上。由此可知，T2和T4不耐膽鹽，但T1和T3對膽鹽的耐受性較好。

2.3抑菌效果研究

益生菌及其代謝產物對人和動物有很好的益生作用，它不但能抑制腸道病原菌和腐敗微生物的生長，而且還能提高人和動物的免疫力。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是環境中最常見的2種致病菌，容易使人患上腸道疾病，而濫用抗生素藥物容易導致耐藥菌株的增加，會引起人和動物的胃腸功能紊亂，使患者的免疫力下降[10-11]，因此益生菌比藥更加安全。4株枯草芽孢桿菌對不同菌落總數的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用結果見表4。

表4　枯草芽孢桿菌對病原菌的抑制作用　(mm，n=3)

抑菌圈的大小分別代表著4株枯草芽孢桿菌的抑菌效果，其抑菌圈越大，抑菌效果就越好。本實驗探究了4株枯草芽孢桿菌對不同菌落總數的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由表3可看出，T1和T3對這2種病原菌都有較強的抑制作用，而T2和T4的抑菌作用較弱。通過統計分析可知，在大腸桿菌菌落數為1.8× 107cfu/mL左右時，T1和T3對其抑制作用最強，抑菌圈直徑分別達到了26.15 mm和35.05 mm。這2株菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用是在金黃色葡萄球菌菌落數為1.2×105cfu/mL左右時最強。

2.4產酶特性研究

在飼料中添加益生菌，它所產生的蛋白酶、淀粉酶能將飼料分解成小分子，從而能有效地提高飼料的營養價值和消化吸收率[12]。因此益生菌在飼料工業中發揮著極其重要的作用，它代表著新型飼料添加劑的發展方向。4株枯草芽孢桿菌產淀粉酶、蛋白酶能力見圖2。

圖2　4株枯草芽孢桿菌的產酶特性

由圖2可知，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3這2株菌分解蛋白酶、淀粉酶的能力較強，尤其是分解蛋白酶的能力更強，其中T1的酪蛋白瓊脂平板的水解圈直徑(J)與菌落直徑(K)的比值大小為3.52，T3的J/K值達到了3.26。而T2和T4相對于T1、T3來說，它們分解這2種酶的能力較弱，特別是T2幾乎不分解蛋白酶。且通過液化能力實驗結果表明，它們的液化能力大小排序為T3＞T1＞T2≈T4。因此，可以初步判斷T1和T3枯草芽孢桿菌能作為用于生產微生態制劑的菌種，它們分解蛋白酶和淀粉酶的能力較強，能應用于動物飼料的生產中，改善飼料的利用率，從而促進動物的生長。

3　結論

本實驗結果顯示，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3具有較強的耐酸性，它們在不同pH值條件下培養2.5 h后其活菌數仍達到了107cfu/mL以上，存活率都在25 %以上；并對0.3 %的膽鹽也具有耐受性，經試驗處理后，其存活率分別保持在30.69 %和46.14 %。

同時T1和T3對病原菌大腸桿菌及金黃色葡萄球菌都具有較好的抑制作用，并且對細菌含量不同的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果不同，其中T1和T3對菌落總數為1.8×107cfu/mL左右的大腸桿菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑分別達到了26.15 mm和35.05 mm，而它們對金黃色葡萄球菌的抑制作用是在菌落總數為1.2× 107cfu/mL左右時最好，抑菌圈直徑分別為12.67 mm和27.15 mm。T1和T3枯草芽孢桿菌分解蛋白酶和淀粉酶的能力也較強，尤其是分解蛋白酶，其J/K值都在3.0以上。

T2及T4菌不耐酸，在pH值為2.0的人工胃液中處理2.5 h后，存活率分別僅為8.70 %和2.45 %；也不耐膽鹽，經試驗處理后存活率低，只達到了8.68 %和6.02 %；對腸道病原菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用也不好，尤其是T2對大腸桿菌的抑制作用最弱；T2幾乎不分解蛋白酶，分解淀粉酶的能力也弱，T4雖然分解這2種酶，但分解能力很差。

因此，根據本實驗結果可初步判斷，從四特酒大曲中分離出的4株枯草芽孢桿菌中，T1和T3的益生特性比較好，具有較高的研究開發價值。

參考文獻：

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“新品速遞”——安琪釀造新品涉足新領域

本刊訊：近年來，湖北安琪公司在釀造領域始終致力于發酵專家形象的建設，先后開發了安琪超級釀酒高活性干酵母、安琪釀酒曲等王牌產品。

此次安琪公司再次推出安琪耐高溫醬油酵母、安琪白酒曲，宣告以新的應用進入新領域。

安琪耐高溫醬油酵母2015年初，安琪公司作為第一承擔者實施的“高耐性酵母關鍵技術研究與產業化”項目獲得國家科學技術進步二等獎。近日，作為對項目成果的重要延伸，安琪公司推出耐高溫醬油酵母。

安琪耐高溫醬油酵母主要應用于中國傳統醬類生產，包括原池澆淋、廣式醬油、東北大醬等多個應用領域。針對國內醬油（醬）釀造工藝特點，耐高溫醬油酵母可以彌補由于釀造溫度過高導致的釀造缺陷，對香氣和滋味上帶來顯著提升。

安琪白酒曲是繼安琪釀酒曲之后，再次推出的復合型酒曲類產品，應用于白酒、醋類生產。

與釀酒曲應用于工業大生產不同，安琪白酒曲主要針對小型設備、手工釀酒，通過對酵母、霉菌、酶等微生物的復合，彌補了釀酒曲在小批量生產中存在的不足，是對安琪產品在白酒生產領域的補充。（皮聰）

Study on Probiotic Properties of Bacillus subtilis Isolated from Site-flavor Daqu

YAN Meiting, LI Haimin, ZHANG Chaofeng, DU Xia and ZHANG Fengying
(College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China)

Abstract:In this study, 4 bacteria strains were isolated from Site-flavor Daqu and then identified as different strains of Bacillus subtilis. The probiotic properties (the tolerance of acid and cholate, antibacterial effects and enzyme-producing properties) of the four strains were studied by simulating animal gastrointestinal environment in vitro. The results showed that, 2 of the 4 acillus subtilis strains had strong tolerance of acid and cholate, they could effectively inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus; and they also had higher decomposition capability of amylase and protease. Therefore, these 2 Bacillus subtilis strains had better probiotic properties.

Key words:Site-flavor Daqu；Bacillus subtilis；probiotic properties

作者簡介：嚴美婷（1992-），女，江西新余人，在讀碩士，研究方向：食品微生物。

收稿日期：2015-11-16

DOI：10.13746/j.njkj.2015437

中圖分類號：TS262.3；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0057-04

優先數字出版時間：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1012.006.html。