富硒黃豆中可溶性硒蛋白的提取工藝

李寶瑞，陳彥卓，韓杰，高俁，張安寧，鐵梅，*（.遼寧大學環境學院，遼寧沈陽0036；.遼寧碧海環境保護工程監理有限公司，遼寧沈陽008）

?

富硒黃豆中可溶性硒蛋白的提取工藝

李寶瑞1，陳彥卓2，韓杰1，高俁1，張安寧1，鐵梅1，*
（1.遼寧大學環境學院，遼寧沈陽110036；2.遼寧碧海環境保護工程監理有限公司，遼寧沈陽110081）

摘要：選擇pH=7.2的磷酸緩沖液為浸提劑從富硒黃豆中提取可溶性硒蛋白，研究了液料比、提取溫度、提取時間對黃豆蛋白提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnen的中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法確定了富硒黃豆中硒蛋白提取的最佳工藝：液料比11∶1（mL/g）；提取溫度44℃；提取時間96 min；在此條件下，可溶性硒蛋白的提取率可達到76.03%。進一步研究表明：富硒黃豆中不僅含有硒蛋白，而且還含有大量的其他有機硒化合物。

關鍵詞：富硒黃豆；硒蛋白；提取工藝

硒（Se）是人和動物的必需微量營養元素，具有重要的生理功能，大量資料證實或提示，硒具有廣泛的生物學作用，在預防克山病、某些癌癥和延緩衰老中發揮著重要作用[1-3]。我國2/3的地區缺硒，大量研究表明有機硒，尤其是蛋白硒毒性小、生物利用率高，因此如何獲取具有生物活性的硒蛋白，已成為人們研究的熱點[4-10]。我國是世界上種植黃豆的主要國家，黃豆具有很高的營養價值，蛋白質含量在豆類中居前列，黃豆也成為了富硒效果較好的農產品[11]。

目前，國內外分離提取黃豆蛋白仍以堿提酸沉為主，但強堿容易引起賴氨酸損失，產生一些有害物質，如賴氨酰胺丙氨酸，還可能造成蛋白質的變性和水解，從而影響其生物活性、營養價值和商業價值[12-14]。因此本研究選取磷酸鹽緩沖溶液為浸提劑，探究富硒黃豆中可溶性硒蛋白提取效果的影響因素，對進一步研究硒蛋白的結構和功能性因子有著重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

富硒黃豆：種植時土壤施硒濃度分別為0、10、20、40 mg/kg；硒標準液（1 000 mg/L）：國家環保總局標準樣品研究所；硝酸、過氧化氫、硝酸鎳均為優級純：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水均為超純水。

1.2儀器與設備

Spectr AA 220型原子吸收光譜儀、cary50UV-Vis分光光度計：美國Varian公司；GTA110型石墨爐、MDS-2002A型壓力自控密閉微波消解系統：上海新儀微波化學科技有限公司；KJELTEC2100型半自動凱式定氮儀：瑞典富斯-特卡托公司；超純水機：美國Millipore公司；XZ-21K高速冷凍離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司、HH-8數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

黃豆樣品采收后，先用大量自來水沖洗，再以超純水洗滌3次，瀝干，裝入塑料袋中，置于-85℃冷凍冰柜冷凍24 h后，再移至真空冷凍干燥系統中，在真空度3.5 Pa，溫度為-55℃條件下進行連續72 h冷凍干燥。粉碎干燥好的樣品，裝入塑料自封袋中，置干燥器中保存備用。

1.3.2黃豆樣品中總硒的測定

稱取0.5 g黃豆粉末于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL HNO3和1 mL H2O2，擰緊外蓋放入微波消化儀，微波消解程序為：第一工步：1 min、0.5 MPa；第二工步：2 min、1.0 MPa；第三工步：3 min、1.5 MPa；消解完成后，在可調試電熱板上加熱趕酸30 min，自然冷卻后用超純水定容至50 mL容量瓶中待測。將硒標準溶液逐級稀釋成硒標準工作母液（250 μg/L），利用自動進樣器軟件稀釋系統將其配成50、100、150、200、250 μg/L濃度繪制標準工作曲線。硒的吸收峰面積（A）與硒濃度（μg/L）在0～250 μg/L范圍內呈線性關系，線性方程為A=0.003 1C+0.014 6（r=0.994 2），檢出限為1.20 μg/L。石墨爐原子吸收光譜儀工作條件及升溫程序見表1。

表1石墨爐升溫程序Table 1 Temperature rising process of graphite furnace

1.3.3黃豆中蛋白的提取

取3 g富硒黃豆樣品，按一定的液料比加入浸提液，在一定溫度和時間下振蕩，25℃下4 000 r/min離心30 min，取上清液在冰浴下緩慢加入4倍溶液體積丙酮于-20℃冰箱放置4 h后，4℃下10 000 r/min離心20 min，棄上清液并在通風櫥吹干丙酮，所得固體即為可溶性蛋白。

1.3.4黃豆中蛋白含量的確定

黃豆中總蛋白和可溶性蛋白的測定采用微量凱式定氮法，參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

富硒黃豆蛋白提取率/ %=可溶性蛋白質含量/黃豆中總蛋白含量×100

1.3.5黃豆蛋白提取單因素試驗

根據蛋白質溶解性的不同，本試驗選擇3種中性浸提劑分別為：pH=7.2的Tris/HCl緩沖液（Tris/HCl）、pH=7.2的磷酸緩沖液（PBS）、9 %的NaCl溶液（NaCl）。以提取黃豆蛋白的液料比、時間、溫度為試驗指標，分別做單因素試驗，并分析各因素對黃豆蛋白提取率的影響。

1.3.6黃豆蛋白提取的響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，以蛋白質的提取率作為試驗指標，根據中心組合設計（Central Composite Design），采用軟件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平試驗，確定黃豆蛋白的最佳提取工藝。

1.3.7黃豆中蛋白硒的測定

在最佳浸提條件下提取富硒黃豆蛋白，取20 mL浸提液于聚四氟乙烯消化罐中，加5 mL HNO3和1mL H2O2置于微波消解儀中消化。微波消解程序及蛋白硒的測定方法見1.3.2。

2　結果與分析

2.1富硒黃豆中硒含量測定結果

采用微波消解與石墨爐原子吸收光譜法對富硒黃豆中的總硒量進行測定，對照組含硒量為58.67 μg/kg，而施硒量為10、20、40 mg/kg的黃豆中含硒量分別為177.58、322.76、629.33 μg/kg。可見隨著土壤施硒量的增加，黃豆中的總硒量呈現上升趨勢。

2.2富硒黃豆中總蛋白含量的測定結果

采用凱式定氮法對黃豆中蛋白進行3次測定，4組黃豆樣品中總蛋白含量分別為37.18 %、38.80 %、39.54 %、39.02 %，說明施硒量的增加，在一定程度上會促進了蛋白的合成。

2.3黃豆蛋白質提取的單因素試驗結果

2.3.1液料比對黃豆蛋白提取率的影響

準確稱取對照組黃豆粉末3 g，按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）加入浸提劑，在30℃振蕩提取30 min，考察液料比對黃豆蛋白提取的影響。結果見圖1。

如圖1所知，通過3種浸提液提取黃豆蛋白比較，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率較高。液料比為5∶1（mL/g）時，蛋白提取率較低，液料比達到10∶1（mL/g）時，蛋白提取率最高，隨著液料比的增加，蛋白提取率沒有明顯變化。因此選擇液料比為10∶1（mL/g）。

圖1液料比對黃豆蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of soybean protein

2.3.2浸提時間對黃豆蛋白提取率的影響

準確稱取對照組黃豆粉末3 g，加入30 mL的浸提液，在30℃下分別提取30、60、90、120、150 min，考察提取時間對蛋白提取率的影響。結果見圖2。

圖2提取時間對黃豆蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of soybean protein

由圖2可知，相同條件下，3種浸提劑中，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率最高，其次是NaCl和Tris-HCl。當提取液為磷酸鹽緩沖液，提取時間為90 min時，蛋白提取率最大。隨著提取時間的增加，蛋白提取率呈現先增高后降低的趨勢。可能是隨著浸提時間的增加，蛋白的溶出逐漸達到飽和，飽和之后因為長時間的振蕩，蛋白質失活，進而使蛋白提取率降低。也有可能是由于液料比和浸提溫度的增加，溶出的蛋白經長時間振蕩出現凝聚引起再沉淀，從而降低了蛋白提取率。因此提取時間選擇90 min。

2.3.3浸提溫度對黃豆蛋白提取率的影響

準確稱取對照組黃豆粉末3 g，加入30 mL浸提液，分別在20、30、40、50、60℃恒溫提取30 min，考察浸提溫度對黃豆蛋白提取率的影響。結果見圖3。

圖3提取溫度對黃豆蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of soybean protein

由圖3可知，磷酸鹽緩沖液的蛋白提取率要明顯高于其他2種浸提劑。隨著溫度的增高，蛋白提取率逐漸增加，但40℃時蛋白提取率開始下降，表明在上述介質中超過40℃就會使蛋白質逐漸變性凝固，降低蛋白溶解度。因此選擇提取溫度為40℃。

2.4黃豆蛋白提取工藝的優化

2.4.1回歸模型的建立

綜合單因素試驗結果，選擇磷酸鹽緩沖液為最適浸提劑。選取溫度、時間和液料比為考察因素，根據響應面分析法中心組合設計原理進行響應面試驗，試驗因素及水平見表2，響應面分析方案及試驗結果見表3。

表2中心組合試驗因素水平編碼表Table 2 Factors and levels in the response surface design

表3響應面分析方案及試驗結果Table 3 Design and results of the response surface methodology for Soybean protein extraction

對表3試驗結果進行多元回歸模擬，得到各試驗因素對響應值的影響回歸方程為：蛋白提取率=74.74+ 6.19A+4.92B+1.73C+1.15AB-0.23AC-0.045BC-7.64A2-3.42B2-1.38C2。通過Design-Expert軟件進行方差分析來驗證回歸模型及各參數的顯著性，結果見表4。

表4模型的ANOVA分析結果Table 4 Variance analysis（ANOVA）for the fitted quadratic regression model

由表4可知，回歸方程中因變量和自變量之間的線性關系顯著（R2=0.968 9），P=0.000 2<0.01，說明次方程極顯著。失擬項P=0.015 6<0.05影響顯著，表明此模型可分析和預測富硒蛋白提取工藝參數。

各因素的影響程度分析，模型中的A、B、A2、B2達到極顯著水平，C、AB影響顯著，AC、BC、C2影響不顯著。由F值可知，影響蛋白質提取率主要因素依次是A>B>C，即液料比>浸提溫度>浸提時間。

2.4.2響應曲面分析

根據回歸分析結果，作出響應曲面圖，響應面曲面的坡度可反映該因素對蛋白質提取率影響的強弱程度，如果一個響應曲面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響到相應值大小，相反，如果一個響應曲面坡度非常陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感。各因素對黃豆蛋白提取率的影響見圖4～圖6。

比較3組圖可知：液料比對蛋白提取率的影響較大，曲線變化較陡；浸提溫度次之；浸提時間對蛋白提取率的影響最小，曲面變化比較平緩。

2.4.3最佳提取條件及驗證

圖4液料比和提取溫度對蛋白提取率影響的響應面Fig.4 Responsive surface of liquid/material ratio and temperature on protein extraction yield

圖5提取溫度和提取時間對蛋白提取率影響的響應面Fig.5 Responsive surface of temperature and time on protein extraction yield

圖6液料比和提取時間對蛋白提取率影響的響應面Fig.6 Responsive surface of liquid/material ratio and time on protein extraction yield

由Design Expert V8.0.6分析軟件得到的最佳浸提條件為：液料比為10.91∶1（mL/g），浸提溫度為43.96℃，浸提時間為95.77 min，理論上蛋白提取率為78.59 %。為了考慮試驗的可行性，將最佳條件調整為液料比為11∶1（mL/g），浸提溫度為44℃，浸提時間為96 min。在此條件下，對對照組黃豆蛋白進行浸提，通過3次平行試驗，測得蛋白提取率為76.03 %，相對誤差為3.26 %，沒有顯著差異。

2.5富硒黃豆中蛋白硒的測定

在最優浸提條件下分別提取4組黃豆樣品中的可溶性蛋白，對其蛋白硒的含量進行測定，結果見圖7。

圖7黃豆中的總硒量及可溶性蛋白的含硒量Fig.7 The concentrations of total-Se and protein-Se in soybeans

由圖7可知，隨著土壤施硒量的增加，蛋白硒的含量大幅上升，對照組蛋白硒含量為15.0 μg/kg，土壤施硒40 mg/kg的黃豆中蛋白硒含量達到60.30 μg/kg。但是，隨著施硒濃度的增加，蛋白硒占總硒的比例呈下降趨勢，對照組為25.57 %，而土壤施硒40 mg/kg的黃豆蛋白硒比例僅為9.58 %，說明在富硒黃豆樣品中，非蛋白硒的比例遠遠大于蛋白硒。表明通過土壤施硒，能使硒在黃豆根莖組織代謝中進一步參與多種生物合成。

3　結論

1）在單因素試驗的基礎上，選擇磷酸鹽緩沖液為浸提劑，利用Design Expert V8.0.6分析軟件進行優化分析得到：各因素對黃豆蛋白提取率影響大小的順序依次是液料比、浸提溫度、浸提時間。提取黃豆可溶性蛋白的最佳工藝參數為液料比11∶1（mL/g），浸提溫度為44℃，浸提時間為96 min，在此條件下蛋白提取率達到76.03 %。表明響應曲面法對于黃豆可溶性蛋白提取條件的優化是可行的。

2）確定了蛋白最優浸提條件后，對4組黃豆中的蛋白硒含量進行測定，并與黃豆中的總硒量對比。結果表明，隨著土壤中施硒量的增加，不僅黃豆中總硒量在增加，而且硒還促進了黃豆中蛋白的合成和蛋白硒的增加。

3）在富硒黃豆樣品中，除蛋白硒以外還大量存在非蛋白硒，且隨著黃豆中總硒量的增加，非蛋白硒增加的比例遠遠大于蛋白硒，表明富硒黃豆中不僅含有大量的蛋白硒，而且還存在著數量可觀的其他有機含硒生物大分子。至于這些非蛋白硒的形態、結構還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] Patrick L. Selenium biochemistry and cancer: a review of the literature[J]. Altern Med Rev, 2004,9(3): 239-258

[2] Hatfield D L, Tsuji P A, Carlson B A. Selenium and selenocysteine: roles in cancer, health, and development[J]. Trends in biochemical sciences, 2014,39(3):112-120

[3] Amoako P O. Speciation of selenium dietary supplements[J].Analytical Chemistry Acta,2009,652(3):315-323

[4] Stephen A. Hypothesis :Iodine, selenium and the development of breast cancer[J].Cancer causes and control, 2000,11(2):121-127

[5] Panigatim, Falciolal. Determination of selenium in Italian rices by differential pulse cathodic stripping voltammetry[J]. Food Chemistry, 2007,105(3): 1091-1098

[6] Moon, Shibamoto. Antioxidant assays for plant and food components [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,57(5):1655-1666

[7]張俊杰.硒的生理功能及富硒強化食品的研究進展[J].微量元素與健康研究,2006,23(3):58-60

[8]寧嬋娟,吳國良.微量元素硒與人體健康及我國富硒食品的開發狀況[J].山西農業科學,2009,37(5):88-90

[9]王慶華,黃偉,李前勇,等.中國富硒食品的生產現狀及趨勢[J].廣東微量元素科學, 2008,15(3):7-10

[10]吳永堯,唐巧玉,周大寨,等.大豆對硒的富集及耐受能力[J].湖北農業科學,2005(3):39-40

[11]矯麗媛,呂敬軍,陸豐升.花生分離蛋白提取工藝優化研究[J].食品科學,2010,31(20):196-201

[12]周麗卿,杜雙奎,趙佳.響應面法優化鷹嘴豆蛋白提取工藝[J].食品科學,2012,33(8):66-70

[13]李燕杰,甄成,陳洪濤.南瓜籽餅粕中蛋白的綜合利用[J].食品研究與開發,2009(8): 173-174

[14]孫燈艷,王曉嵐,張連富.富硒靈芝中可溶性硒蛋白的提取工藝研究[J].食品工業科技,2008,29(3):219-221

Extraction of Soluble Selenium-containing Protein from Selenium-enriched Soybean

LI Bao-rui1，CHEN Yan-zhuo2，HAN Jie1，GAO Yu1，ZHANG An-ning1，TIE Mei1，*
（1 College of Environment，Liaoning University，Shenyang 110036，Liaoning，China；2 Liaoning Bihai Environmental Protection Engineering Supervision Company，Shenyang 110081，Liaoning，China）

Abstract：Soluble selenium-containing protein was extracted from selenium-enriched soybean by PBS（pH= 7.2）.The effects on protein extraction rate by the factors，such as liquid/ material ratio，temperature and extract time were studied. According to the single factor experiments，the optimum of extract process for seleniumenriched soybean protein was determined through Box-Benhnken central composite design and response surface methodology. The result showed that optimal condition of extraction were：liquid/material ratio 11∶1（mL/g）；extraction temperature 44℃；extraction time 96 min.Under the optimized extraction conditions，the yield of soluble selenium-containing protein was 76.03 %. Further studies showed：selenium-enriched soybean not only had selenium-containing protein，but also had other selenium-containing compounds.

Key words：selenium-enriched soybean；selenium-containing protein；extracting technology

收稿日期：2014-10-14

*通信作者

作者簡介：李寶瑞（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：土壤、農作物、食品中微量元素的檢測方法、形態分析、遷移轉化規律等。

基金項目：國家自然科學基金項目（31371085）；遼寧省科技廳項目（2011205001）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.015