30份海南地區(qū)引種甘薯種質(zhì)資源的SSR分析

南文卓，張小貝，蘇一鈞，祝志欣，曹清河，朱國鵬＊

（1．海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口570228；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所，江蘇徐州甘薯研究中心，江蘇徐州221121）

30份海南地區(qū)引種甘薯種質(zhì)資源的SSR分析

南文卓1，張小貝1，蘇一鈞2，祝志欣1，曹清河2，朱國鵬1＊

（1．海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，海南海口570228；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所，江蘇徐州甘薯研究中心，江蘇徐州221121）

為熱帶地區(qū)甘薯引種和新品種培育提供重要的理論依據(jù)，通過農(nóng)藝性狀比較篩選出在海南地區(qū)適應(yīng)性較好的30份甘薯引種種質(zhì)資源，利用SSR分子標記技術(shù)對30份甘薯種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，明確其在DNA分子水平上的遺傳差異。結(jié)果表明：11對SSR引物可擴增出57條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶53條，多態(tài)性百分率93．0%，平均每對引物5．18條。經(jīng)遺傳相似性和聚類分析，30個甘薯品種遺傳相似性系數(shù)在0．42～0．96，平均為0．62，甘薯品種間遺傳多樣性較豐富。以0．61的相似系數(shù)為閾值，30份材料聚成3大類。

海南地區(qū)；甘薯；SSR；遺傳多樣性

甘薯（Ipomoea batatas Lam．）又名紅薯、番薯等，為旋花科番薯屬。甘薯起源于南美洲，在世界范圍內(nèi)被廣泛引種栽培。中國自明朝引入甘薯以來，長期以種植國外引進品種為主［1］。建國后，中國在引種基礎(chǔ)上進行的甘薯品種改良取得十分顯著的成效，培育了如徐薯18和南薯88等優(yōu)良品種。不同甘薯品種的區(qū)域適應(yīng)性差異較大，對于海南地區(qū)，甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸是品種問題［2］。尋求海南地區(qū)適應(yīng)性較好的甘薯品種，并了解其遺傳多樣性，對于海南地區(qū)優(yōu)良品種的培育具有重要意義。關(guān)于甘薯的遺傳多樣性目前已有較多學(xué)者利用不同分子標記方法對其進行研究，Prakash等［3］利用RAPD分子標記法對30個美國品種分析發(fā)現(xiàn)，所有品種都具有惟一的指紋圖譜；Elameen等［4］認為，AFLP技術(shù)可有效區(qū)分其收集的甘薯種質(zhì)資源；甘學(xué)德［5］利用ISSR技術(shù)對49份甘薯種質(zhì)分析表明，各種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)處于0．58～0．93［6］。SSR（Simple Sequence Repeat，簡單序列重復(fù)）是真核生物基因組中普遍存在的一種重復(fù)序列，一般由1～6個堿基組成。與RAPD、RFLP等分子標記相比，SSR標記為共顯性標記，可揭示更多的多態(tài)性，并區(qū)分種質(zhì)資源的純合和雜合狀況。另外，SSR在實驗中對DNA模板的用量和質(zhì)量要求相對較低，結(jié)果重復(fù)性好，較AFLP、RAPD及ISSR等分子標記技術(shù)具有更高的可靠性［7］。SSR分子標記已成功應(yīng)用于小麥、水稻、馬鈴薯、玉米和棉花等作物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建［8－12］，成為目前應(yīng)用最廣泛的分子標記之一。張超凡等［13］通過SSR分子標記法發(fā)現(xiàn)，甘薯材料的聚類圖和系譜圖相吻合，說明SSR分子標記同樣適用于甘薯遺傳多樣性的檢測。為挖掘熱帶地區(qū)甘薯育種材料，尋求適宜海南地區(qū)種植的優(yōu)良甘薯品種，筆者所在課題組從多地引進種質(zhì)資源50多份，經(jīng)海南大學(xué)海甸校區(qū)（海口市）基地1年試種，觀察農(nóng)藝性狀，選擇其中表現(xiàn)較好的30份材料（包括紫薯6份），以SSR技術(shù)對其進行遺傳多樣性研究，旨在為熱帶地區(qū)甘薯引種及新品種培育提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1材料來源

試驗材料取自海南大學(xué)海甸校區(qū)基地（表1）的30份種質(zhì)（包括紫薯6份）。30份種質(zhì)是由課題組從多地引進的50多份種質(zhì)資源中經(jīng)海南大學(xué)試種1年觀察農(nóng)藝性狀后選擇而得。

表1 試驗材料的引種編號及種質(zhì)資源名稱Table 1 No．a(chǎn)nd name of test materials in the study

1．2試驗方法

1．2．1基因組DNA的提取與檢測 取各供試材料的頂端葉片（每種材料隨機取3～4個單株的幼嫩葉片各1片混合），置于已編號的保鮮袋中并迅速帶回實驗室，用CTAB法對其基因組DNA進行提取，并跑膠檢測。

1．2．2SSR分析 試驗引物為江蘇徐州甘薯研究中心從數(shù)百對引物中篩選出的30對引物。PCR反應(yīng)體系為25μL：模板DNA 1μL（100ng／μL）；上下游引物各lμL（10μmol／L）；2×PCR mix 12．5μL；ddH2O 9．5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，共32個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，硝酸銀染色，并拍照分析。

1．3數(shù)據(jù)分析

對膠板上較清晰條帶進行記錄，數(shù)字1和0分別代表供試材料在此等位基因上條帶的有無，有帶記為“1”，無帶記為“0”。利用NTSYSpc2．1軟件計算種質(zhì)資源之間的遺傳相似系數(shù)，然后用UPGMA方法進行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2．1SSR引物篩選

在江蘇徐州甘薯研究中心提供的30對引物基礎(chǔ)上，以能擴增出清晰條帶為標準，從中篩選出11對引物（表2）。用這11對SSR引物對30份甘薯材料DNA進行擴增，共擴增出57個清晰條帶，其中多態(tài)性條帶為53條，多態(tài)性百分率達93．0%，平均每對引物擴增出5．18個條帶。引物C55擴增出等位基因位點最多，為9個，引物Z91較少，為3個（圖1）。

表2 11對SSR引物組合的序列Table 2 The 11SSR primer pairs and their nucleotide sequences

圖1 引物C 55和引物Z91對30份甘薯種質(zhì)的SSR分析Fig．1 Segregation of 30sweet potato varieties by Z91（Maker：DL2000）and C55

2．2甘薯品種間遺傳差異

從表3看出，30份甘薯材料間的遺傳相似性系數(shù)在0．42～0．96，平均為0．62。種質(zhì)間相似性系數(shù)在0．90～0．99的占0．46%，在0．80～0．89、0．70～0．79、0．60～0．69、0．50～0．59、0．40～0．49的分別占1．38%、14．94%、37．47%、37．47%和8．28%。其中，海南引種4（處理編號22）和山川紫（處理編號26）遺傳相似性最低，為0．42。紅遙（處理編號16）和宮崎紅（處理編號17）之間遺傳相似性系數(shù)最高，達0．96，可能是同一種質(zhì)資源，出現(xiàn)該結(jié)果主要由2個原因造成：一是地方間相互引種造成混淆，二是不同地方同一品種的名稱不一。

表3 30份甘薯材料的遺傳相似性系數(shù)Table 3 Genetic similarity matrix of 30sweet potato varieties based on SSR

續(xù)表3

2．3 30份材料的聚類分析

在遺傳相似性系數(shù)為0．61處可將30份材料分為3大類（圖2）：第Ⅰ類包括龍巖4、海南引種3、海南引種4、海南引種5、美國番薯、京6和寧紫薯4，共7種材料；第Ⅱ類包括龍巖5、遺138、三角戀、泰國番薯、蘇薯17、山川紫、寧紫薯2、紅遙和宮崎紅，共9份材料；第Ⅲ類包括心香、廣薯87、寧46、高系14、51－93、川1、龍巖4、海南引種1、海南引種2、寧紫薯1、30、蘇薯16、越南板栗和印尼番薯，共14種材料。6份紫薯以及國外引種的甘薯種質(zhì)資源分別被聚類在不同類群中。

圖2 30份甘薯種質(zhì)資源基于SSR遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類Fig．2 UPGMA cluster analysis of the 30sweet potato varieties based on genetic similarity coefficients of SSR marker

3結(jié)論與討論

1）研究采用SSR分子標記法對海南地區(qū)引種的30份甘薯材料進行遺傳多樣性分析，擴增得到清晰條帶57條，其中多態(tài)性條帶53條，多態(tài)性百分率93．0%。30份材料遺傳相似性系數(shù)在0．42～0．96，平均為0．62，表明其遺傳多樣性較豐富。同樣利用SSR分子標記技術(shù)，張超凡等［13］得到的湖南地方甘薯的遺傳多樣性系數(shù)為0．273～0．627，Veasey等［14］調(diào)查巴西圣保羅傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)家庭擁有的甘薯種質(zhì)遺傳多樣性的結(jié)果為0．31～1．0，Yada等［15］對192份烏干達甘薯種質(zhì)的研究結(jié)果為0．23～0．76。比較不同的研究結(jié)果可知，地方和國外甘薯種質(zhì)遺傳多樣性變化范圍更廣，種質(zhì)間遺傳差異更大。因此，充分保護和利用地方種質(zhì)，加大國外種質(zhì)引進是甘薯種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。

2）對30份甘薯引種材料的聚類分析表明，其在DNA水平上的遺傳聚類結(jié)果與根據(jù)其引種來源地聚類結(jié)果并不相符，如來自江蘇的蘇薯16和寧紫薯1、蘇薯17和寧紫薯2被分別聚類到第Ⅲ類和第Ⅱ類。國內(nèi)種質(zhì)資源與引自國外的甘薯種質(zhì)資源在樹狀圖上的位置相互交錯，地域性不強，與趙冬蘭等［16］對甘薯聚類得出的結(jié)論一致。6份紫薯被聚類在不同樹狀分枝中，說明按照薯肉顏色分類的結(jié)果并不能代表其在DNA水平上整體多態(tài)性。在聚類圖中可以推測紅遙和宮崎紅可能為同一種質(zhì)資源。因此，甘薯種質(zhì)資源的鑒定和種質(zhì)名稱的統(tǒng)一也至關(guān)重要，更顯示出建立指紋圖譜的必要性。SSR分子標記技術(shù)不受外界環(huán)境、發(fā)育時期、取樣器官等限制，且操作簡便、結(jié)果準確可靠，利用SSR分子標記技術(shù)建立甘薯指紋圖譜，可很好進行甘薯品種鑒定。SSR引物C55具備多態(tài)性明顯、重復(fù)性較好等要求，可作為建立甘薯指紋圖譜的有效引物。

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［2］鄭有東．海南番薯產(chǎn)業(yè)化分析和發(fā)展對策［J］．中國種業(yè)，2014（1）：26－27．

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［4］ELAMEEN A，F(xiàn)JELLHEIMS，LARSEN A，et al．A－nalysis of genetic diversity in a sweet potato（Ipomoea batatas L．）germplasm collection from Tanzania as revealed by AFLP［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2008，55：397－408．

［5］方宣鈞，無為人，唐紀良．作物DNA標記輔助育種［M］．北京：科學(xué)出版社，2000．

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（責(zé)任編輯：姜 萍）

SSR Analysis on 30 Sweet Potato Germplasm Resources Introduced to Hainan Area

NAN Wenzhuo1，ZHANG Xiaobei1，SU Yijun2，ZHU Zhixin1，CAO Qinghe2，ZHU Guopeng1＊

（1．College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou，Hainan570228；2．Xuzhou Sweet potato Research Center，Institute of Sweet Potato，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xuzhou，Jiangsu221121，China）

To provide a theoretical basis for sweet potato introduction and new varieties cultivation in tropical region，through assessment of the agronomic traits，the authors selected 30sweet potato germlines with good adaptability in Hainan area．In this study，the genetic diversity of these 30sweet potato germlines was analyzed by SSR molecular marker technology，thus to clarify the genetic variation at DNA molecular level．Results：57clear and reproducible SSR bands could be recorded according to the electrophoresis results of 11pairs of SSR primers．Among them，53were polymorphic bands，with an average of 5．18bands per primer pair and the percentage of polymorphism up to 93．0%．the analysis of the genetic similarity and UPGMA clustering showed that coefficients of genetic similarity varied from 0．42to 0．96with the mean of 0．62，indicating high genetic diversity．Using the genetic similarity value of 0．61as the threshold，the 30germlines were clustered into three clades．

Hainan area；sweet potato；SSR；genetic diversity

S531

A

1001－3601（2016）12－0490－0001－05

2016－07－12；2016－12－01修回

農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗示范財政專項（2015南亞熱帶作物專項）“熱作無公害生產(chǎn)技術(shù)集成與示范推廣”（15RZNJ－57）；海南省星火產(chǎn)業(yè)帶項目“優(yōu)質(zhì)富硒菜用甘薯周年生產(chǎn)技術(shù)示范與推廣”（HNXH201530）；海南省自然科學(xué)基金項目“海南富硒地區(qū)甘薯硒的富集能力、賦存形態(tài)及分布規(guī)律研究”（20163067）

南文卓（1991－），女，在讀碩士，研究方向：甘薯育種。E－mail：10134332862＠qq．com

＊通訊作者：朱國鵬（1971－），男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事植物營養(yǎng)學(xué)、園林植物與觀賞園藝研究。E－mail：guopengzhu＠163．com