沙棘三寶膠囊干預大鼠肝纖維化的作用※

馬 英，王曉臨

(1.青海大學醫學院；2.青海大學附屬醫院)

沙棘三寶膠囊干預大鼠肝纖維化的作用※

馬 英1，2，王曉臨2#

(1.青海大學醫學院；2.青海大學附屬醫院)

目的 研究沙棘三寶膠囊對大鼠肝纖維化的影響。方法 將大鼠隨機分為空白對照組(16只，生理鹽水1.0 mL/kg)、陰性對照組(16只，橄欖油1.0 mL/kg)和肝纖維化模型組(40只，CCL4+橄欖油1.0 mL/kg)。將成功造模大鼠分為模型組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)、沙棘三寶膠囊組(每組8只，沙棘三寶膠囊低、中、高劑量組，劑量分別為0.13、0.26、0.65 g/kg)。每天灌胃給藥1次，連續60天。使用生化分析儀檢測血清中肝功能相關指標ALT、AST，使用放射免疫法檢測透明質酸(HA)、IV型膠原(CIV)的變化并做組織病理學觀察。結果 中、高劑量的沙棘三寶膠囊能夠明顯降低肝纖維化大鼠HA、ALT、AST含量(P<0.05)并能抑制大鼠肝組織纖維化增生。其中，中劑量藥物干預肝纖維化的作用更優。結論 沙棘三寶膠囊對大鼠肝纖維化有一定的干預作用。

沙棘三寶膠囊 肝纖維化 作用

實驗用沙棘三寶膠囊由沙棘、山楂、枸杞等組成，甘草浸膏少許，其中主要成分為沙棘，生產批號為青衛食證字(2009)第630000-400004號。本研究旨在探討沙棘三寶膠囊對肝纖維化的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

SPF級SD大鼠72 只，體重200±20 g，雌雄各半，由甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗室提供(實驗動物許可證號SYKX(甘)2011-0001)。實驗前適應性喂養5天。隨機選取16只作為空白對照組，16只作為陰性對照組，雌雄各半；其余40只大鼠用于構建肝纖維化動物模型。大鼠飼養溫度：25 ℃左右，濕度：50%，光照：7 am～7 pm開燈。期間大鼠自由獲取飲食及飲水。

1.2 大鼠肝纖維化模型構建

將CCL4和橄欖油以1：1(V/V)的比例混勻后灌胃給藥(1.0 mL/kg)，空白對照組和陰性對照組分別以相同劑量的生理鹽水和純橄欖油灌胃，每天一次，持續灌胃60天。從空白對照組、陰性對照組和模型建立組中各取8只，禁食不禁水過夜，第二天空腹稱重，麻醉后腹腔動脈取血，分離血清，取肝臟、脾臟稱重，用10%福爾馬林溶液固定肝組織；檢測血清肝纖維化指標，觀察肝組織病理切片，判斷模型是否成功建立。

1.3 實驗

實驗用沙棘三寶膠囊的使用劑量為0.13、0.26、0.65 g/kg(其中將成人劑量通過人與實驗動物等效公式換算后得出實驗用藥的中劑量)。將實驗開始時16只空白對照組動物所剩8只分至空白組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)，16只陰性對照組動物所剩8只分至陰性組(8只，橄欖油1.0 mL/kg)，將成功造模大鼠分為模型組(8只，生理鹽水1.0 mL/kg)、沙棘三寶膠囊組(每組8只，沙棘三寶膠囊低、中、高劑量組，劑量分別為0.13、0.26、0.65 g/kg)。6組實驗動物每天灌胃一次，60天后，各組禁食不禁水過夜，第二天空腹稱重，麻醉后腹腔動脈取血，分離血清；取肝臟稱重，用10%福爾馬林溶液固定肝組織。

1.4 血清檢測及組織病理學觀察

大鼠腹腔動脈取血后離心(4 ℃，3000 r/min)取血清，使用生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)；放射免疫法檢測透明質酸(HA)、IV型膠原(CIV)。觀察各組病理組織切片圖，褐色部分均為肝組織纖維化部分，褐色組織越多，肝纖維化程度越重。

1.5 統計學處理

數據的統計處理使用SPSS19.0軟件包，計量資料以均數±標準差描述，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD法，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 模型建立后實驗動物臟器系數數據統計

根據公式：肝臟系數=肝臟重量(g)/動物采血前重量(g)×100%；脾臟系數=脾臟重量(g)/動物采血前重量(g)×100%；計算模型建立終期時空白組、陰性對照組和模型建立組實驗動物的臟器系數。由實驗結果可知，模型組實驗動物的肝臟系數明顯高于空白對照組和陰性對照組，且有統計差異(P<0.05)(見表1)。

表1 不同處理方法對肝纖維化模型大鼠肝臟系數及脾臟系數的影響結果(n=8)

*：與空白組對比，P<0.05；#：與陰性組對比，P<0.05.

2.2 模型建立后實驗動物生化指標檢測

實驗發現，將CCL4和橄欖油以1：1(V/V)的比例混勻后灌胃給藥(1.0 mL/kg)60天后，大鼠生化指標ALT、AST、HA明顯高于空白組、陰性對照組，而CIV未發生明顯變化(見表2)。說明該方法成功構建大鼠肝纖維化模型。

表2 不同處理方法對肝纖維化模型大鼠血清生化指標檢測結果的影響結果(n=8)

*：與空白組對比P<0.05；#：與陰性組對比P<0.05.

2.3 給藥60天后大鼠血清生化指標檢測

模型組大鼠ALT、AST、HA均高于空白組(P<0.05)，沙棘三寶膠囊低劑量組與模型組對比，HA降低較模型組明顯(P<0.05)；ALT、AST均未見降低趨勢；給藥中劑量組與模型組相比，ALT、AST、HA均呈明顯降低趨勢(P<0.05)。給藥高劑量組與模型組相比，AST、HA均呈較明顯降低趨勢(P<0.05)，ALT雖數值上有降低，但結果無統計學差異；給藥中劑量組與高劑量組相比，中劑量組藥物下調肝纖維生化指標AST、ALT的作用更優于高劑量組(P<0.05)；各組之間CIV未發生明顯變化。

表3 不同處理方法對肝纖維化大鼠血清生化指標檢測結果的影響結果(n=8)

*：與空白組對比，P<0.05；#：與模型組對比，P<0.05；△：與中劑量組比，P<0.05.

2.4 沙棘三寶膠囊對肝纖維化大鼠肝組織中I、Ⅲ型膠原表達的影響

圖1為大鼠肝臟組織中I型膠原的表達情況。從圖中可以看出，模型組與空白組對照，褐色的纖維化組織明顯增多。沙棘三寶膠囊中劑量組與模型組相比，肝纖維化程度降低，中劑量組的效果更好。

圖1 各組大鼠肝臟組織中I型膠原蛋白檢測結果圖(1×400)

圖2為大鼠肝臟組織中Ⅲ型膠原的表達情況。從圖中可以看出，模型組與空白組對照，褐色的纖維化組織明顯增多。沙棘三寶膠囊中劑量組與模型組相比，肝纖維化程度降低。其中沙棘三寶膠囊的低、中、高三個劑量中，中劑量組效果更好。

圖2 各組大鼠肝臟組織中Ⅲ型膠原蛋白檢測結果圖(1×400)

3 討論

肝纖維化是肝臟疾病的重要轉歸，它的特點是細胞外的間質過分沉積，是肝臟疾病向肝硬化進展的早期階段，但其可以被逆轉[1]。目前臨床上診斷肝臟疾病主要靠血清學檢測。HA為蛋白多糖的一種，是細胞外基質的主要成分之一，能夠作為肝纖維化和肝硬化的檢測指標，具有較好的敏感性和特異性，能夠反映肝細胞的受損情況。在肝纖維化的過程中，檢測血清生化指標如AST、ALT等都能不同程度地反映肝臟病變程度[2]。

通過動物實驗證明沙棘籽油在保護肝細胞及有效調節機體免疫等方面有重要作用，它能夠抑制四氯化碳(CCL4)誘導的肝纖維化發展的進程[3]。在本實驗中，模型構建期間，模型組的動物血清HA、AST、ALT與空白組對比顯著升高，該現象與機體肝纖維化過程中各指標的改變趨勢一致。并且模型動物的肝臟系數升高，體重降低，也證明動物模型構建成功。給藥60天后，空白組血清HA、AST、ALT卻比模型組低，說明模型組動物在正常的生理情況下，具有自行恢復的特點，但纖維化水平仍大于空白組。給藥60天后，沙棘三寶膠囊中劑量組、高劑量組與模型組對比，ALT、AST、HA均低于模型組。我們發現給藥中劑量組沙棘三寶膠囊下調ALT、AST的作用優于高劑量組。模型組的檢測值明顯高于空白組和陰性對照組，說明模型構建成功。

本研究結果提示，沙棘三寶膠囊對肝臟保護基于下調ALT、AST的機制。模型組值降低，是實驗動物自身恢復的結果；給藥組值降低，是藥物治療肝纖維(主要)和動物自身恢復(附加)的雙重結果。沙棘三寶膠囊對肝纖維化大鼠肝組織中I、Ⅲ型膠原表達的影響顯示，中、高劑量組與模型組相比，肝纖維化程度明顯減輕，其中中劑量組的效果更為明顯。實驗過程中CIV在各組間無明顯差異。

綜上所述，用CCL4和橄欖油可以成功構建肝纖維化模型。中、高劑量的沙棘三寶膠囊能夠明顯降低肝纖維化大鼠HA、ALT、AST含量(P<0.05)，并能抑制大鼠肝組織纖維化增生。其中，中劑量藥物干預肝纖維化的作用更優。

[1]Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases：structure，function，and biochemistry[J].Circ Res.2003，92(8)：827-39.

[2]孫蕾.不同程度肝纖維化患者的血清學檢驗分析[J].臨床輸血與檢驗.2016，18(2)：144-145.

[3]施彥，徐婧，劉超，等.沙棘籽油對小鼠實驗性肝纖硬化的保護作用及參數分析[J].醫學研究生學報，2006，1：40-42.

The effect of Sanbaofructushippophaecapsules on hepatic fibrosis in rats

MA Ying1，2，WANG Xiao-lin2

(1.QingHai University Medical College；2.Qinghai University Affiliated Hospital)

Objective To investigate the effect of Sanbaofructushippophaecapsules on hepatic fibrosis in rats.Methods SD rats(200±20 g) were randomly divided into 3 different group：blank group(n=16，normal saline1.0 mL/kg)，negative control group(n=16，olive oil 1.0 mL/kg)and model group(n=40，CCL4+olive oil1.0 mL/kg).After establishing the model of hepatic fibrosis，the rats were randomly divided into model group(n=8，normal saline1.0 mL/kg)，Sanbaofructushippophaegroup(low，middle and high dose groups，the dosage were 0.13，0.26，0.65 g/kg，respectively.).These regents were intragastrically administrated to the rats for 60 consecutive days.The level of ALT，AST in blood were detected by biochemistry method.The level of HA，CIV were detected by radioimmunoassay.The histopathological change of liver was tested by immunohistochemical method.Results The level of HA，ALT，AST was decreased in middle and high dosage of Sanbaofructushippophae(P<0.05).Also the degree of hepatic fibrosis was reduced.We found that the middle dosage of Sanbao showed better effect in rats.Conclusion Sanbaofructushippophaeshows a protective effect on hepatic fibrosis in rats.

SanbaofructushippophaeHepatic fibrosis Mechanism

R575.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.004

2016-06-09

※：青海省(應用)基礎研究計劃項目(2013-Z-729) 馬英(1990～)，男，回族，青海籍，2014級科學班研究生

#：通信作者，博士，E-mail：wangxl63@126.com