蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響

李寧，李磊，趙登攀，李曉濤，張曉峰*

(1.上海市中醫醫院實驗中心，上海　200071；2. 華東師范大學生命科學學院 上海　200241)

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·實驗研究·

蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響

李寧1，李磊2，趙登攀2，李曉濤2，張曉峰1*

(1.上海市中醫醫院實驗中心，上海200071；2. 華東師范大學生命科學學院 上海200241)

【摘要】目的研究蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響。方法利用免疫蛋白印跡檢測小鼠睪丸中REGγ的表達；通過組合酶消化法分離精原干細胞，流式細胞儀檢測精原干細胞中c-kit及α6-integrin的表達；通過小鼠精子分析儀檢測REGγ基因敲除雄鼠的精子濃度和精子活力；進行小鼠合籠實驗檢測正常雌鼠和REGγ基因敲除雄鼠合籠后的生育力。結果REGγ在小鼠睪丸中高表達；應用組合酶消化法得到了純度70%的精原干細胞；REGγ基因敲除雄鼠精原干細胞的c-kit及α6-integrin表達量均顯著低于野生型組(P<0.05)；REGγ基因敲除型雄鼠的平均精子濃度(37.1×106/ml)和精子活力(54%)均顯著低于野生型雄鼠(75.4×106/ml、74%)(P<0.05)；REGγ基因敲除型雄鼠與野生型雌鼠合籠后的產仔數均低于野生型雄鼠(P<0.05)。結論蛋白酶體REGγ參與調節雄鼠的生精功能。

【關鍵詞】REGγ；生精；精原干細胞

(JReprodMed2016，25(3)：242-247)

11S蛋白酶體激活因子γ(REGγ)系蛋白酶體激活因子REG家族成員蛋白，通過非泛素和ATP依賴途徑催化蛋白酶體20S的蛋白水解活性[1-2]。過去認為，REGγ只能促進蛋白酶體降解一些細胞內的短肽，但是不能降解細胞內完整的蛋白分子[3]，此觀念一度影響了科學家對REGγ的重視程度。2006年，Li等[3]首次發現了REGγ-20S蛋白酶體的第一個細胞內完整的蛋白分子底物SRC-3，隨后，又相繼發現了另外一些細胞內完整的蛋白分子底物，如細胞周期抑制蛋白p21、p16和p14等[4-5]，促進了對REGγ功能的認識。越來越多的證據顯示REGγ可能在許多生理以及病理過程中發揮重要的生物學功能。REGγ通過不同機制調控p53的穩定性及活性，進而發揮特定的生物學功能[6-7]；在有絲分裂過程中，REGγ可以維持染色體穩定的功能，REGγ在核斑點的形成過程中發揮重要的功能[8]。近期發現，REGγ通過降解B細胞活化誘導激活胞嘧啶核苷脫氨酶影響B細胞抗體多樣化的產生[8]；一些研究也表明，REGγ與許多癌癥的發生發展也密切相關[9-11]。本文研究了REGγ對雄性小鼠生殖功能的影響。

材料與方法

一、試劑和儀器

主要試劑：膠原酶VI、透明脂酸酶、胰酶(Sigma，美國，20140913、20140822、20140911)；優質胎牛血清(NBS)、DMEM培養基(Gibco，美國，批號140820)；羊抗鼠REGγ單克隆抗體抗體、羊抗鼠PLZF單克隆抗體(Santa Cruz，美國，批號20140911、20141119)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天)。

儀器：CytoFLEX流式細胞儀(BECKMAN COULTER，美國)；Odessey雙色激光掃描成像系統(Li-Cor Bioscience，美國)；FlexStation3酶標分析儀(MolecularDevices，美國)；Tanon-6600凝膠成像系統(上海天能科技)；GNP型二氧化碳培養箱(上海精宏實驗設備)；HTM-IVOS精子活力測定儀(徐州信達醫療)。

二、實驗方法

1. 實驗動物：野生型及REGγ基因敲除型C57BL6小黑鼠購自John Monaco教授實驗室，在華東師范大學SPF級動物房飼養[12]。合籠實驗按照以下方式進行：首先用REGγ雜合子雄鼠和REGγ雜合子雌鼠進行合籠，得到同窩的野生型雄鼠和REGγ基因敲除型雄鼠，然后用得到的同窩型野生型雄鼠(野生型組)及REGγ基因敲除雄鼠(基因敲除型組)分別和野生型雌鼠合籠。

2. 精原干細胞的分離與純化：參照Pramod的方法[13]，取7～8 d齡雄性小鼠12～15只，頸椎脫臼法處死。無菌收集兩側睪丸，置于盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的小皿中。整個睪丸收集過程在30 min內完成。用尖鑷子仔細去除每個睪丸的脂肪墊、附睪及睪丸白膜，加入適量PBS(2～3 ml)，吸管用力吹打，將曲細精管吹散。加入相當于組織體積10倍的含1 g/L膠原酶的PBS后入溫箱，在37 ℃、5% CO2條件下作用15 min (期間晃動數次)。之后移入5 ml的離心管，輕緩吹打1～2次，靜置待曲細精管段沉降后輕輕吸除上清，再重復上述過程1次。加入含1.5 g/L透明質酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入溫箱，同樣條件下作用5～10 min，倒置顯微鏡下見曲細精管段軟散，有的已消散成單細胞或小的細胞團即可。加入含10% NBS、1%青、鏈霉素的新鮮DMEM培養液終止消化，移入離心管中，1 000 r/min離心3 min或靜置5 min，待軟散的曲細精管及已解離的精原干細胞沉降后，輕輕吸去上清。重新加入1.5 ml新鮮培養基(DMEM+10% FBS+1% 青、鏈霉素)，吹打8～10次，吹打數次制成單細胞懸液。在7～8 d齡小鼠的睪丸曲細精管上皮上，只存在2種類型的細胞，即A型精原干細胞和支持細胞。將制備的單細胞懸液接種置CO2培養箱中培養，根據支持細胞與精原干細胞貼壁速度快慢的差異，利用選擇性貼壁法，待支持細胞開始貼壁極化而精原干細胞仍然懸浮時(體外培養約6～7 h)，將未貼壁的精原干細胞隨培養基離心收集，準備進行流式細胞檢測。

3. 堿性磷酸酶染色鑒定精原干細胞：按照試劑盒進行操作。

4. 流式細胞儀測定c-kit與α6-interin：將收集到的精原干細胞分別添加c-kit與α6-interin抗體，37 ℃孵育1 h，加入到流式細胞儀中進行分析。

5. 小鼠精子濃度及活力鑒定：取8～10周性成熟雄鼠，剖腹取出兩側附睪，剪刀剪開附睪并置于事先準備好的凹形玻璃皿內，37 ℃放置5 min，使精子充分釋放出來。5 min后，去除組織碎片，用細的玻璃虹吸管依靠虹吸作用吸取含精子的培養液，置于HTM-IVOS精子活力測定儀中測定。精子濃度過高時需要用培養基進行稀釋后再進行測定。

6. 免疫蛋白印跡(Western blotting)小鼠睪丸中REGγ蛋白的表達：提取大腦、唾腺、肺、胃、結腸、腎、睪丸、附睪及胸腺組織。用脫頸椎法處死野生型成年小鼠后，迅速采集上述組織置于研缽中并加入液氮低溫研磨，用組織裂解液進行裂解，進行免疫蛋白印跡實驗。

7. 免疫組織熒光檢測：取1周齡雄鼠睪丸，4%多聚甲醛固定過夜，常規石蠟包埋，切成4 μm切片。按組織免疫熒光常規步驟操作。一抗1∶1 000稀釋。免疫熒光顯微鏡掃描成像。

三、統計學分析

結果

一、精原干細胞的分離及鑒定

1. 采用組合酶消化、選擇性貼壁的方法，分離得到的精原干細胞，經細胞計數統計結果表明，精原干細胞的純度可以達到75%以上(表1)。

表1　組合酶消化法分離純化精原干細胞的結果

2.堿性磷酸酶染色結果：堿性磷酸酶染色結果顯示，精原干細胞有褐色附著物(圖1A)。

3. 流式細胞儀及精子濃度、活力分析結果：在6～8 d的小鼠睪丸中存在兩種細胞，分別是精原干細胞和支持細胞。通過分離精原干細胞并檢測其特定基因的表達，分析REGγ基因對小鼠精原干細胞的影響，從而得到其對雄性生殖的影響。流式細胞儀分析表明，野生型小鼠精原干細胞α6-integrin 與c-kit基因的表達均高于REGγ 基因敲除小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1 B)。對10對野生型雄鼠和REGγ基因敲除型雄鼠測量結果進行統計分析，結果顯示：野生型雄鼠平均精子濃度為75.4×106/ml，精子活力為74%；而REGγ基因敲除型雄鼠平均精子濃度為37.1×106/ml，精子活力為54%。從結果可以看出，敲除REGγ導致了雄性小鼠精子濃度和精子活力的降低，與野生型組相比，差異有統計學意義(圖2)。

與野生型組比較，*P<0.051A：堿性磷酸酶鑒定結果×100　1B：流式細胞儀檢測結果圖1　精原干細胞的分離鑒定

與野生型組比較，*P<0.052A：REGγ基因敲除雄鼠與野生型雄鼠精子濃度　2B：REGγ基因敲除雄鼠與野生型雄鼠精子活力圖2　REGγ基因敲除雄鼠精子濃度和精子活力

二、REGγ在睪丸組織中高表達

相對于其他組織，REGγ在睪丸中表達量很高，提示REGγ可能在雄性生殖方面發揮了一定的生物學功能(圖3)。REGγ與PLZF蛋白表達位置一致，由于PLZF是精原干細胞標志分子，通過對1周齡野生型雄鼠睪丸組織檢測表明，REGγ與PLZF在精原干細胞中共表達于細胞核內(圖4)。

圖3　Western blotting檢測REGγ在成年小鼠各個組織表達分布

圖4　REGγ和PLZF在精原干細胞中共表達 免疫熒光染色法 ×20

五、REGγ基因敲除雄鼠后代減少

REGγ基因敲除雄鼠在繁殖后代的能力方面顯著低于野生型雄鼠 (P<0.05)。野生型雌鼠在與REGγ基因敲除雄鼠合籠時，其產生后代的周期變長，且每窩產生的小鼠后代數目有顯著的減少(表2)。

表2　野生型組(REGγ+/+)和基因敲除型組(REGγ-/-)

注：與野生型組比較，*P<0.05

討論

真核生物細胞中存在不同種類的能夠激活20S的激活因子，如19S，11S等，形成各種結構不盡相同的20S蛋白酶體與調節亞基的復合物[14]。其中兩種蛋白酶體激活因子PA200與REGγ有很高的相似度。PA200在DNA損傷修復中有很重要的作用[15]，而REGγ能夠通過影響p21、p53的水平作用于細胞周期[6]，提示PA200與REGγ作用的相似性。有研究表明[16]，PA200參與小鼠精子發生的過程，而與PA200有極高相似性的REGγ在雄鼠睪丸組織中有很高的表達，因此，有必要對REGγ在小鼠生精過程中的作用進行深入的探討。

為了獲得高純度的小鼠精原干細胞用于REGγ功能的研究，根據參考文獻報道[13]，本實驗利用改進的組合酶消化法將生精小管制成細胞懸液，組合酶包括膠原酶IV、胰蛋白酶和透明質酸酶。膠原酶IV和透明質酸酶主要消化細胞間質，對細胞影響不大。胰蛋白酶的短時、多次消化可以減少對細胞的損傷，并能充分分離精原干細胞和支持細胞。實驗結果顯示，這種組合酶消化法可以制備出高含量和高質量的精原干細胞懸液。然后利用兩次選擇性貼壁法收集精原干細胞，所得細胞70%以上均為精原干細胞。實驗證明，此方法分離得到的細胞數量多，純度比較高，增生旺盛，而且分離時間短，污染機會少，工作效率顯著提高。

在小鼠及大鼠的睪丸中，kit配體是由支持細胞分泌的，而c-kit受體則存在于A型精原干細胞上。在B型及初級精母細胞為低水平表達，在精子細胞中不表達，因此，c-kit受體可作為A型精原干細胞的標志物，但該受體并不是精原干細胞特有的標志物，在其它干細胞中也有表達，故也常作為干細胞的一個常見的輔助檢測指標[17]，結合精原干細胞膜表達蛋白α6-整合蛋白[18]，利用流式細胞儀技術，表明在REGγ基因敲除雄鼠睪丸內，精原干細胞數目明顯減少，而精原干細胞是精子發生的起點，精原干細胞數目的減少對精子發生過程產生影響并導致精子濃度的降低，最終表現為REGγ基因敲除雄鼠生殖能力的下降。

REGγ在睪丸組織內高表達，表明REGγ有可能在睪丸中發揮著某種生物學功能。本文通過對野生型及REGγ基因敲除雄鼠進行系統的研究分析，發現敲除REGγ基因使得雄性小鼠生殖能力降低，主要表現在以下幾個方面：(1)與REGγ基因敲除雄鼠合籠的野生型雌鼠產生的后代數目減少；(2)REGγ基因敲除雄鼠精子濃度降低；(3)REGγ基因敲除雄鼠精子活力降低。這幾個指標的高低都代表著雄性生殖能力的強弱。相比較于野生型雄鼠，ERGγ基因敲除雄鼠這幾個指標數值的降低，表明REGγ基因敲除雄鼠的生殖能力降低。

通過對野生型及REGγ基因敲除雄鼠睪丸組織切片進行免疫熒光染色，發現REGγ敲除雄鼠睪丸內精原干細胞的數目較野生型雄鼠有一定程度減少。REGγ基因敲除雄鼠睪丸內PLZF陽性細胞較野生型雄鼠有明顯減少，表明REGγ基因敲除雄鼠睪丸內PLZF蛋白含量的減少導致了精原干細胞數目的減少。

PLZF是未分化的精原干細胞的標志蛋白，而且對于維持精原干細胞的自我更新發揮著重要的作用[19]。REGγ蛋白酶體的激活可以刺激P53蛋白的降解，P53/TGF-β信號通路可以通過REGγ的過表達干擾REGγ-20S蛋白酶體的信號通路。通過降解P53蛋白介導的對精原干細胞重要因子PLZF的轉錄調控，導致REGγ基因敲除雄鼠睪丸內PLZF蛋白的低表達，并最終導致精原干細胞數目減少[2]。但是REGγ是如何通過P53介導，其具體的信號通路是否只是通過PLZF轉錄調控，或者有其它的通路還需要通過進一步的實驗進行驗證。

總之，REGγ敲除小鼠精子濃度、活力以及后代數目明顯低于野生型小鼠，初步驗證了其在小鼠生精過程中的重要功能，揭示了REGγ在雄性生殖系統中的關鍵作用，為REGγ在男性不孕不育病癥的治療提供了一定的理論基礎。

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[編輯：侯麗]

Effects of REGγ on spermatogenesis of male mouse

LINing1，LILei2，ZHAODeng-pan2，LIXiao-tao2，ZHANGXiao-feng1*

1.ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine，Shanghai200071

2.CollegeofLifeScience，EastChinaNormalUniversity，Shanghai200241

【Abstract】

Objective： To study the effect of REGγ on mouse spermatogenisis.

Methods： The expression of REGγ in mouse testis was detected by using Western blot. The spermatogonial stem cells was isolated by enzymatic digestion method. The expression of c-kit and α6-integrin in spermatogonial stem cells were detected by using flow cytometry. The sperm concentration and motility of REGγ knockout mouse were analyzed by computer assisted sperm analysis system. The fertility of offspring of REGγ knockout and wild type mouse was investigated by mating experiment.

Results： REGγ was highly expressed in mouse testis. About 70% purity of spermatogonial stem cells were obtained by enzymatic digestion method. The expression of c-kit and α6-integrin in spermatogonial stem cells from knockout mice was significant lower than that from wild type mice (P<0.05). Besides，both sperm concentration (37.1×106/ml vs. 75.4×106/ml)and sperm motility (54% vs. 74%) in knockout mice were significantly lower in REGγ wild type mice (P<0.05). The numbers of offspring of REGγ knockout of REGγ mice were significantly less than that of wild type male mice (P<0.05).

Conclusions： REGγ is involved in regulation of spermatogenisis.

Key words：REGγ；Spermatogenesis；Spermatogonial stem cells

【作者簡介】李寧，男，河北保定人，碩士，工程師，發育生物學專業.(*通訊作者)

【基金項目】上海市自然科學基金國際合作項目(項目編號：14430712100)

【收稿日期】2015-09-09；【修回日期】2015-10-13

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.009