脆江蘺多糖體內抗腫瘤活性及其作用機制

鞠瑤瑤，葉天文，謝 飛，陳美珍（汕頭大學理學院，廣東 汕頭 515063）

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脆江蘺多糖體內抗腫瘤活性及其作用機制

鞠瑤瑤，葉天文，謝 飛，陳美珍*
（汕頭大學理學院，廣東 汕頭 515063）

摘 要：目的：研究脆江蘺多糖（Gracilaria chouae polysaccharides，GLP）的體內抗腫瘤活性。方法：以GLP為受試物，考察其對S180肉瘤荷瘤小鼠的抗腫瘤活性，同時通過測定小鼠機體免疫系統各項生化指標，初步探討GLP的抗腫瘤作用機制。結果：GLP對S180荷瘤小鼠具有較強的抑瘤活性，當小鼠的GLP腹腔注射劑量為100 mg/（kg?d）（以體質量計）時，抑瘤率達到34.75%，高于中劑量灌胃組（200 mg/（kg?d））的抑瘤率（31.35%）。同時，S180荷瘤小鼠免疫器官指數極顯著增大（P＜0.01），GLP還激活了S180荷瘤小鼠淋巴細胞的增殖分化，S180荷瘤小鼠白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平極顯著上升（P＜0.01），IL-10水平極顯著下降（P＜0.01），GLP對免疫系統顯示出較好的保護作用。結論：GLP具有較強的抗腫瘤活性，且腹腔注射給藥效果優于灌胃給藥。GLP對小鼠機體免疫調節作用可能是其抗腫瘤作用的主要機制之一。

關鍵詞：脆江蘺多糖；抗腫瘤；免疫作用

引文格式：

鞠瑤瑤,葉天文,謝飛,等.脆江蘺多糖體內抗腫瘤活性及其作用機制[J].食品科學,2016,37(5):208-213.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605037.http://www.spkx.net.cn

JU Yaoyao,YE Tianwen,XIE Fei,et al.Antitumor activity in vivo and mechanism of action of Gracilaria chouae polysaccharides[J].Food Science,2016,37(5):208-213.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605037.http://www.spkx.net.cn

江蘺是紅藻門（R h o d o p h y t a）、真紅藻綱（Florideae）、杉藻目（Gigartinales）、江蘺科（Gracilariaceae）、江蘺屬（Gracilaria）的統稱[1]，脆江蘺（Gracilaria chouae）為江蘺屬的一種大型經濟類海藻。江蘺含有豐富的多糖、膳食纖維、維生素、礦物質等，具有降血脂[2]、抗氧化[3]、抗輻射[4]等保健功效。國內外研究表明，海藻多糖具有抗腫瘤、抗輻射、清除自由基、延緩衰老等作用[5-6]，陳美珍[7]、宮春宇[8]等的研究表明江蘺屬的龍須菜多糖可顯著增強機體免疫活性；Fan Yanli等[9]研究發現龍須菜酸性多糖可有效抑制H22肝癌細胞的生長；Sun Liqin等[10]亦報道了紅藻門的紫球藻多糖可有效抑制S180肉瘤的生長和增強機體免疫力。誘導腫瘤細胞凋亡[11-12]是海藻多糖的抗腫瘤機制之一，Sarangi[13]、Lee[14]、Zhang Mei[15]等的研究均證明了多糖可將腫瘤細胞周期阻滯于不同時期，從而誘導腫瘤細胞凋亡；此外，海藻多糖還可通過激活淋巴細胞[16]、提高荷瘤小鼠免疫器官指數[17]、激活巨噬細胞并促進相關細胞因子的分泌[18-21]等途徑間接發揮抗腫瘤活性。

脆江蘺是一種新型的養殖海藻，目前已在廣東省南澳沿海人工養殖成功并可大面積種植。作者前期研究發現脆江蘺含有占藻體干質量29.47%的多糖，脆江蘺多糖（Gracilaria chouae polysaccharides，GLP）對體外培養的宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7和人食管癌細胞EC-109的生長抑制率分別達到49.11%、41.18%、34.98%和31.33%，并均存在劑量依賴關系[22]。在此基礎上，本研究進一步探究GLP的體內抗腫瘤活性及其作用機理，以期為GLP的開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料、動物與試劑

GLP按照實驗室前期建立的優化工藝制備：將原材料洗凈、烘干、粉碎得干粉。取干粉按一定料液比熱水浸提，經離心、醇沉、三氯乙酸除蛋白質、透析72 h后，冷凍干燥得多糖樣品。苯酚-硫酸法[23]測得GLP樣品中多糖含量為96.32%，考馬斯亮藍法[24]測得GLP蛋白質含量為0.63%。使用時用雙蒸水將GLP配制成不同劑量，其中注射用樣品配制后需過濾除菌。人宮頸癌HeLa細胞株由汕頭大學多學科中心提供。

S P F級昆明種雄性小鼠7 0 只，體質量（23.62±1.25）g；SPF級S180腹水瘤雌性小鼠（38.25 g）。以上兩種小鼠均購于廈門大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（閩）2004-0001。

DMEM高糖培養基 美國HyClone公司；胎牛血清 杭州四季青科技有限公司；胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液 碧云天生物技術研究所；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；陽性藥物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU） 上海源葉生物科技有限公司；伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA） 廣州市齊云生物技術有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）ELISA試劑盒、小鼠白細胞介素-10（IL-10）ELISA試劑盒、小鼠干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2儀器與設備

BCM-13WA超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；BT124S型電子分析天平 德國Sartorius公司；臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；3111型CO2細胞培養箱 美國Thermo公司；CK30倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡 日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；－65 ℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；全波段掃描酶標儀 瑞士Tecan公司；石蠟切片機 德國Leica公司。

1.3方法

1.3.1S180荷瘤小鼠移植瘤模型的建立

將取自S180腹水瘤小鼠的S180瘤株在昆明種小鼠體內腹水傳代3 次，每次7 d。無菌條件抽取最后一次荷瘤小鼠腹水，用預冷的無菌生理鹽水調整細胞濃度至1.5×107個/mL，在昆明種小鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 mL瘤細胞懸液。

1.3.2動物分組與給藥

雄性昆明小鼠適應性喂養3 d后，按體質量隨機分為7 組，各組體質量無顯著差異，每組10 只，即正常對照組（NM組）、模型組（TM組）、陽性對照組（5-FU組）和實驗組，實驗組又分為GLP灌胃給藥低劑量組（L-GLP組）、中劑量組（M-GLP組）、高劑量組（H-GLP組），以及注射給藥組（I-GLP組）。

實驗第1天，除NM組外，各組小鼠于左前肢腋窩皮下接種0.2 mL細胞濃度為1.5×107個/mL的S180瘤細胞懸液。第2天開始按實驗設計劑量給藥，實驗組給予GLP溶液，其中L-GLP組、M-GLP組、H-GLP組分別灌胃給予150、200、250 mg/（kg?d）（以體質量計，下同）的GLP；I-GLP組給予100 mg/（kg?d）的GLP；5-FU組腹腔注射20 mg/（kg?d）的5-FU；NM與TM組灌胃等量生理鹽水。連續給藥8 d，每天一次，飼養過程中，小鼠自由采食、飲水，隔日更換墊料。期間觀察小鼠的精神活動、毛發改變狀況、體質量變化等。

1.3.3樣本采集

實驗第10天，稱量小鼠體質量，眼眶取血，3 800 r/min離心8 min，分離血清，無菌條件下取瘤塊、肝臟、脾臟、胸腺等器官稱質量，用預冷的無菌生理鹽水洗滌數次，血清保存于－20 ℃冰箱；腫瘤組織于4%甲醛固定，于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.4GLP對荷瘤小鼠免疫功能的影響

按1.3.3節方法在無菌條件下取得小鼠肝臟、脾臟、胸腺等器官稱質量并進行各項免疫指標的測定。

1.3.4.1免疫器官指數的計算

按照公式（2）計算小鼠免疫器官指數。

1.3.4.2荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的測定

無菌條件下取小鼠脾臟制備單細胞懸液，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基稀釋至2×106個/mL，得細胞懸液。細胞懸液加入到96 孔培養板，每孔200 μL，并做4 個復孔，其中3 孔加入5 μL 200 mg/L的ConA溶液（終質量濃度為5 mg/L），剩余一孔為對照。置培養箱培養3 d，于培養結束前4 h取出，吸出100 μL上清液，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h。培養結束并吸出液體，每孔加入150 μL在37 ℃條件下預溫的DMSO，充分振蕩，酶標儀作雙波長檢測，檢測波長570 nm，參考波長630 nm，按照公式（3）計算脾臟淋巴細胞增殖轉化率[25]。

式中：A處理為ConA孔吸光度；A對照為對照孔吸光度。

1.3.4.3荷瘤小鼠自然殺傷（natural killer，NK）細胞殺傷活性的檢測

采用MTT法檢測小鼠NK細胞殺傷活性[26]。無菌條件下取小鼠脾臟制備單細胞懸液作為效應細胞（細胞濃度2×106個/mL），取傳代培養的HeLa細胞作為靶細胞（細胞濃度2×105個/mL）。取靶細胞懸液100 μL加入96 孔板（每組4 個平行），提前培養8 h。向其中3 孔中加入等體積效應細胞，剩余孔作為靶細胞對照，并設效應細胞對照，加入等量效應細胞。將細胞于培養箱中培養4 h，結束后吸出上清液100 μL，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液繼續孵育4 h；培養結束后吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，充分振蕩，酶標儀作雙波長檢測，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。按照公式（4）計算NK細胞殺傷活性。

式中：A靶細胞為靶細胞孔吸光度；A實驗為靶細胞與效應細胞共同作用孔吸光度；A效應細胞為效應細胞孔吸光度。

1.3.4.4荷瘤小鼠血清中TNF-α水平的測定

取1.3.3節所收集的血清，采用生物素雙抗體夾心ELISA法測定小鼠血清中TNF-α的水平。具體操作按照TNF-α ELISA試劑盒說明書方法進行。

1.3.4.5荷瘤小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ水平的測定

取1.3.3節所收集的血清，應用雙抗體夾心法分別測定小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ的含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法操作。

1.3.5小鼠腫瘤組織病理學觀察

取4%甲醛固定的小鼠腫瘤組織樣本，按常規方法制作切片和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光鏡下觀察腫瘤組織病理學變化，具體操作按文獻[27]的方法進行。

1.4數據統計分析

采用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，數據均以表示。兩組間數據比較采用t檢驗，以P＜0.05判斷為差異具有顯著性。

2　結果與分析

2.1GLP的抗腫瘤作用

表1　GLP對荷瘤小鼠S180腫瘤的抑制作用（x±s，n＝1100）Table 1 Antitumor activity of GLP on S180 tumor-bearing mice x ,= 10)

由表1可知，GLP對S180荷瘤小鼠有顯著的抑瘤作用。各實驗組小鼠的瘤質量與TM組相比均呈現顯著差異；其中，M-GLP組抗腫瘤效果較H-GLP組更好，說明GLP的抗腫瘤效應存在最適劑量，并非劑量越高越好。而使用低劑量注射的I-GLP組抑瘤率達34.75%，高于M-GLP組抑瘤率（31.35%），且與模型組相比呈現出極顯著差異（P＜0.01），說明注射給藥方式更能發揮GLP的抗腫瘤作用。

2.2GLP對荷瘤小鼠免疫功能的影響

2.2.1GLP對荷瘤小鼠免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，它們能在一定程度上反映機體免疫功能的狀況[28-29]，胸腺指數和脾臟指數的大小直接反映機體免疫水平的高低[30]。GLP對荷瘤小鼠免疫器官的影響如表2所示。造模后TM組小鼠的肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數均降低，表明移植瘤對小鼠機體免疫器官產生了較強的損傷。5-FU組荷瘤小鼠的脾臟指數、胸腺指數相對于TM組均降低，意味著荷瘤小鼠免疫器官受到嚴重損傷，說明5-FU存在較大的副作用；而各實驗組小鼠的脾臟指數、胸腺指數均有不同程度增加，表明GLP可拮抗腫瘤細胞對機體免疫器官的損傷，對免疫器官具有明顯的保護作用。

表2　脆江蘺多糖對S180荷瘤小鼠肝臟、脾臟和胸腺指數的影響（x±s，n＝1100）Table 2 Effect of GLP on liver index,spleen index and thymus index of S180 tumor-bearing mice(x ,= 10)mg/10 g

2.2.2GLP對荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

圖1　脆江蘺多糖對S180荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響（x±s，n＝1100）Fig.1 Effect of GLP on proliferation of spleen cells in S180 tumor-bearing mice(x± s,,n　==　10)

由圖1可知，同NM組相比，TM組小鼠脾臟淋巴增殖轉化率極顯著降低（P＜0.01），說明移植瘤對小鼠免疫系統產生了極大的破壞作用；而各實驗組均能極顯著改善這一作用，使小鼠脾臟淋巴細胞的增殖轉化能力增強，其中I-GLP組小鼠的脾臟淋巴細胞增殖轉化率達到95.03%，與TM組相比，脾臟淋巴細胞增殖能力極顯著增強（P＜0.01）。

2.2.3GLP對荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響

NK細胞是機體重要的免疫細胞，在機體早期免疫監視中起重要作用[31]。如圖2所示，與NM組相比，TM組及5-FU組荷瘤小鼠NK細胞殺傷活力顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明腫瘤移植后小鼠的免疫系統受到損傷，導致淋巴細胞分化為NK細胞的能力減弱；與TM組相比，I-GLP組荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性顯著提高（P＜0.05），達到43.62%。以上結果表明，GLP能夠促進荷瘤小鼠淋巴細胞分化為NK細胞。

圖2　GLP對S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響（x±s，n＝1100）Fig.2 Effect of GLP on cytotoxic activity of NK cells in S180 tumor-bearing mice(x± s,,n　==　10)

2.2.4GLP對荷瘤小鼠血清中TNF-α水平的影響

TNF-α是一種由單核巨噬細胞產生的低分子蛋白質，能夠直接殺傷或抑制腫瘤細胞，也可通過對機體免疫功能的調節，促進T細胞和其他殺傷細胞產生對腫瘤細胞的殺傷，在免疫應答中發揮重要作用[32]。由圖3可知，各實驗組荷瘤小鼠脾淋巴細胞分泌TNF-α的水平較TM組均有所升高，其中I-GLP組TNF-α水平極顯著升高（P＜0.01），升至23.46 pg/mL；以上結果提示GLP能促進或激活脾淋巴細胞分泌TNF-α，提高機體免疫系統對腫瘤細胞的殺傷能力。

圖3　GLP對S180荷瘤小鼠血清TNNFF--α水平的影響（x±s，n＝1100）Fig.3 Effect of GLP on serum TNF-α level in S180 tumor-bearing mice(x± s,,n　==　10)

2.2.5GLP對荷瘤小鼠血清中IL-2、IL-10、IFN-γ水平的影響

如表3所示，與TM組相比，各實驗組（除L-GLP組外）荷瘤小鼠血清中IL-2水平均有不同程度升高，其中I-GLP組的IL-2水平極顯著高（P＜0.01）。這表明GLP可通過提高小鼠外周血IL-2水平增強小鼠的免疫功能。與TM組相比，M-GLP組、H-GLP組、I-GLP組荷瘤小鼠血清中的IFN-γ水平均呈現極顯著上升的趨勢（P＜0.01）。與TM組相比，M-GLP組、H-GLP組、I-GLP組IL-10水平均呈現極顯著下降的趨勢（P＜0.01）。

表3　GLP對S180小鼠血清中IL-2、IL-10、IFFNN--γ含量的影響（x±s，n＝1100）Table 3 Effect of GLP on IL-2,lL-10 and IFN-γ in serum of S180 tumor-bearing　miiccee(x ± s,,n　==　10)ng/L

2.3小鼠腫瘤組織病理學觀察

圖4　腫瘤組織病理學特征（HE，10×2200）Fig.4 Histopathological observations of tumor tissues(HE,10 × 20)

由圖4可知，TM組荷瘤小鼠的腫瘤組織細胞體積較大且排列緊密有規則、細胞核染色較深、胞漿和細胞間質少、細胞質部分染色不明顯，表明造模成功。5-FU組荷瘤小鼠的腫瘤組織出現較多病灶，纖維化壞死組織面積較大；各實驗組荷瘤小鼠的腫瘤組織細胞變小、細胞數量減少、排列疏松、腫瘤細胞核溶解，并出現淋巴細胞和巨噬細胞浸潤現象。由于腫瘤組織細胞壞死增多，切片可觀察到大量纖維狀病灶，其中I-GLP組荷瘤小鼠的腫瘤出現大面積的纖維狀壞死組織。以上結果表明GLP可誘導小鼠腫瘤細胞壞死，促進淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，呈現較強的抗腫瘤作用。

各實驗組小鼠腫瘤組織病理學的變化結果，進一步支持了上述GLP以注射給藥方式更能發揮其抗腫瘤作用的結論。

3　討 論

體內實驗結果表明，各劑量GLP灌胃組均能極顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，其中M-GLP組抗腫瘤效果比H-GLP組更好；原因可能是H-GLP組多糖劑量過高、黏度過大，影響了機體對其吸收；這也說明了多糖抗腫瘤效應存在最適劑量。I-GLP組抗腫瘤效果較灌胃給藥組效果更好，說明多糖抗腫瘤效應存在最適給藥方式。可能原因為腹膜密布血管和淋巴管，腹腔注射后藥物通過腹膜等生物膜直接吸收，且吸收相對完全；灌胃時影響藥物吸收的因素很多，如胃腸分泌的消化液、胃腸中的內容物等都會影響藥物的吸收利用率。

經動物實驗和臨床觀察表明，惡性腫瘤的發生發展過程伴隨機體免疫功能的降低[28]。本實驗造模成功的S180荷瘤小鼠胸腺和脾臟均出現一定程度的萎縮，致使免疫器官指數下降，證實腫瘤的發生發展會導致機體免疫功能的降低。

多糖抗腫瘤機制與其促進機體免疫系統的活力有關[33]。給藥后，部分實驗組小鼠的免疫器官指數、脾臟淋巴細胞增殖轉化率及分泌TNF-α的能力均明顯提高，說明GLP可通過促進脾淋巴細胞增殖分化增強細胞免疫功能。

IL-2，又名T細胞生長因子（T cell growth factor，TCGF），不僅能活化T細胞、促進細胞因子產生，還可刺激NK細胞增殖、增強NK細胞殺傷活性，進而促進B細胞增殖及免疫應答[34]。IFN-γ與IL-2同來源于活化的Thl細胞，IFN-γ不僅能活化NK細胞，還可抑制Th2細胞分化[35]。IL-10主要由Th2細胞分泌，抑制Thl型細胞合成分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子。IL-10水平升高將使機體處于免疫抑制狀態，使病情加重。本實驗結果表明，各實驗組小鼠血清中細胞因子IL-2、IFN-γ水平升高，IL-10水平降低。這說明GLP可通過促進Thl細胞因子分泌、抑制Th2細胞因子分泌、增強機體免疫功能，從而達到抗腫瘤的目的。

綜上所述，GLP具有較強的抗腫瘤活性，其抗腫瘤機制與提高機體免疫功能關系密切。本實驗結果可為進一步研究GLP生理活性提供理論基礎。

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Antitumor Activity in Vivo and Mechanism of Action of Gracilaria chouae Polysaccharides

JU Yaoyao,YE Tianwen,XIE Fei,CHEN Meizhen*
(College of Science,Shantou University,Shantou 515063,China)

Abstract:Objective:To investigate the antitumor activity of polysaccharides from Gracilaria chouae(GLP)in vivo.Methods:S180 sarcoma mouse model was established and used for the determination of antitumor activity of GLP in vivo.In addition,the underlying mechanism was explored by measuring biochemical parameters of immune system in the mice.Results:GLP definitely had inhibitory effect on S180 sarcoma in vivo.An inhibition rate of 34.75% was obtained with intraperitoneal injection at a dose of 100 mg/(kg·d),higher than that(31.35%)of the medium-dose intragastric administration group(200 mg/(kg·d)).Immune organ indices of tumor-bearing mice significantly increased(P < 0.01).Additionally,the proliferation and the differentiation of lymphocytes was activated by GLP administration.The levels of IL-2 and IFN-γ significantly increase(P < 0.01),while the level of IL-10 significantly decreased(P < 0.01).GLP showed good protection on the immune system.Conclusion:GLP had strong anti-tumor activity and was more effective when given by intraperitoneal injection than by intragastric administration.The anti-tumor effect of GLP was mainly achieved by improving immune function in mice.

Key words:Gracilaria chouae polysaccharides(GLP); antitumor; immunological effect

中圖分類號：R931

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0208-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605037

*通信作者：陳美珍（1956—），女，教授，本科，主要從事活性物質研究與開發。E-mail：chenmz@stu.edu.cn

作者簡介：鞠瑤瑤（1988—），女，碩士研究生，主要從事活性物質研究與開發。E-mail：12yyju@stu.edu.cn

基金項目：廣東省科技計劃項目（2013B0203012005）；2013年汕頭大學實驗教學示范中心項目（生物學實驗教學中心）；2013年廣東省高等學校教學質量與教學改革工程本科類立項建設項目（汕頭大學生物學實驗教學示范中心）

收稿日期：2015-04-27