藏靈菇源克魯維酵母菌M3調節大鼠腸道菌群平衡的研究

董牧群，熊利霞，謝遠紅，張紅星，劉 慧,*，賈 慧，連正興（.北京農學院食品科學與工程學院，微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 006；.中國農業大學動物科技學院，北京 0009）

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藏靈菇源克魯維酵母菌M3調節大鼠腸道菌群平衡的研究

董牧群1，熊利霞1，謝遠紅1，張紅星1，劉 慧1,*，賈 慧1，連正興2
（1.北京農學院食品科學與工程學院，微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 102206；2.中國農業大學動物科技學院，北京 100091）

摘 要：利用從藏靈菇中篩選出的發酵性能優良且產膽鹽水解酶的馬克斯克魯維酵母菌M3菌株，制備凍干菌粉作為受試物進行動物實驗，探討其對預防性高膽固醇血癥大鼠腸道菌群平衡的作用。采用預防高膽固醇血癥大鼠模型，將40 只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級3 周齡的大鼠分為高脂模型組、低劑量、中劑量和高劑量實驗組進行實驗。實驗組分別灌胃低、中、高劑量的受試物，高脂模型組灌胃蒸餾水，連續7 周。結果表明，前5 周4 組大鼠糞便中乳酸桿菌（lactobacilli）、沙門氏菌（Salmonella）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的數量處于平緩變化狀態，且3 個實驗組與高脂模型組相比無顯著性差異；5 周時，3 個實驗組大鼠糞便中乳桿菌的數量極顯著高于高脂模型組（P＜0.01），沙門氏菌的數量極顯著低于高脂模型組（P＜0.01），產氣莢膜梭菌的數量顯著低于高脂模型組（P＜0.05）；其中低劑量組的乳桿菌數量最高而沙門氏菌和產氣莢膜梭菌數量最低，說明低劑量實驗組優于中、高劑量實驗組。顯示藏靈菇源克魯維酵母菌M3能夠調節高膽固醇血癥大鼠腸道有益菌的生長，并抑制有害菌的繁殖，具有良好的調節腸道菌群平衡的效果。

關鍵詞：藏靈菇；馬克斯克魯維酵母菌；動物實驗；腸道菌群平衡

引文格式：

董牧群,熊利霞,謝遠紅,等.藏靈菇源克魯維酵母菌M3調節大鼠腸道菌群平衡的研究[J].食品科學,2016,37(5):197-201.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605035.http://www.spkx.net.cn

DONG Muqun,XIONG Lixia,XIE Yuanhong,et al.Regulatory effect of Kluyveromyces marxianus M3 isolated from Tibetan kefir on the intestinal flora balance in rats[J].Food Science,2016,37(5):197-201.(in Chinese with English abstract)

腸道菌群是一個復雜的微生態系統，在正常生理條件下參與維生素的合成、膽汁酸的降解、營養物質的消化及局部和全身的免疫[1]。肥胖、高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病及抗生素等藥物的使用，均會引起腸道菌群失衡[2]。當肝臟發生病變時，會造成脂質代謝紊亂，肝細胞膽汁排泌減少，腸蠕動減慢，微絨毛損傷，消化道功能減弱，腸道清除、排空能力降低[3]，腸道抗體、溶菌酶、黏液分泌減少，腸壁局部抵抗力下降[4]，使得有害菌數量增長甚至占優勢，造成嚴重的腸道菌群失衡。有研究報道，肝功能損害越嚴重腸道菌群失調越嚴重[5]。

課題前期采用高通量篩選技術，從藏靈菇中分離篩選并鑒定出發酵性能優良的馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）M3，經實驗證明K.marxianus M3可在生長代謝過程中產生高活力膽鹽水解酶，且產量較高；又經體外實驗證明其具有較強的耐胃腸道逆環境特性和良好的降膽固醇功效[6]。

目前，國內外對乳酸菌調節腸道菌群平衡的研究報道頗多，而對酵母菌調節腸道菌群平衡的研究少見報道。伍靜等[7]利用抗生素干擾建立小鼠腸道菌群失衡模型，并利用乳酸桿菌制劑進行調節治療。Angelakis等[8]研究了乳酸菌對小鼠體質量、腸道菌群的作用。Bruzzese等[9]利用乳酸菌對患有囊胞性纖維癥的兒童進行隨機臨床實驗，證明其對腸道菌群失衡和腸炎有恢復作用。童佩[10]探討了布拉酵母調節兒童腸道菌群失調造成的便秘與腹瀉的療效。有關藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌促進有益菌的生長，調節腸道菌群平衡的研究尚未見報道。本實驗通過對預防性高膽固醇血癥大鼠灌胃不同劑量馬克斯克魯維酵母菌M3，檢測大鼠糞便中乳酸桿菌（lactobacilli）、沙門氏菌（Salmonella）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的活菌數量，研究馬克斯克魯維酵母菌M3調節預防性高膽固醇血癥大鼠腸道菌群平衡的效果，旨在為開發研制酵母菌功能性食品提供科學理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）M3，從藏靈菇中篩選并鑒定為高產膽鹽水解酶的菌株[11]。

優化發酵條件下對馬克斯克魯維酵母菌M3進行發酵培養，經離心濃縮和真空冷凍干燥后，得到活菌數量達108CFU/g的凍干菌粉，與溫熱蒸餾水以1∶5（m/V）的比例制備受試物。

1.1.2動物

40 只3 周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級斷乳健康雌性Wistar大鼠，體質量130～150 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號SCXK（京）2006-0009。

1.1.3動物飼料與灌胃劑量

SPF級高脂飼料（78.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽）、SPF級基礎飼料（20.8%粗蛋白、4.5%粗脂肪、6.83%粗灰分、10%水分、4.4%粗纖維、1.23%鈣、0.96%磷），均由北京科澳協力飼料有限公司提供，許可證編號SCXK（京）2009-0012。

低、中、高劑量實驗組分別以體質量按照0.5、1.0、2.0 mL/（100 g? d）進行受試物灌胃，高脂模型組灌胃蒸餾水。

1.1.4培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基（g/L）：馬鈴薯200.0、葡萄糖20.0、瓊脂15.0。

乳酸細菌瓊脂培養基（MRS）（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉粉5.0、酵母粉4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸三銨2.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.05、瓊脂15.0，吐溫-80 1.0 mL，pH值調至6.2±0.1。

亞硫酸鉍瓊脂培養基（BS）（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉粉5.0、葡萄糖5.0、磷酸氫二鈉4.0、硫酸亞鐵0.3、亞硫酸鈉6.0、檸檬酸鉍銨2.0、煌綠0.025、瓊脂18.0，pH值調至7.5±0.1。

亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂基礎培養基（sulfite polymixin sulphadiazine agar，SPS）（g/L）：胰酪胨15.0、酵母粉10.0、檸檬酸鐵0.5、瓊脂15.0，pH值調至7.0±0.1。

Biolog鑒定儀專用[12]標準BUY（biolog universal yeast）培養基和YT微孔接種板。

1.2 儀器與設備

7080型日立全自動生化分析儀 日本日立公司；752紫外-可見分光光度計 北京東南儀城實驗室設備廠；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機廠；Biolog MicroStation微生物快速鑒定儀 美國Biolog公司；Moticam1300數碼顯微攝像系統 Motic實業集團；DL-CJ-IND型無菌超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SKP-02.500型恒溫培養箱 黃石恒豐醫療器械有限公司。

1.3方法

1.3.1飼養條件

實驗大鼠于北京大學醫學部動物實驗室飼養。大鼠均飼養于SPF級環境，5 只/籠，自由采食、采水，室內通風條件良好，正常晝夜變化，相對濕度為40%～70%，室溫18～24 ℃。

1.3.2分組與處理

實驗大鼠適應性飼養7 d后，將大鼠分為高脂模型組、低劑量、中劑量和高劑量實驗組，實驗大鼠均飼喂高脂飼料，實驗組灌胃受試物，高脂模型組灌胃蒸餾水，連續7 周。每周稱體質量1 次，并依此調整灌胃量。

1.3.3糞便的采集

在動物實驗第1、3、5、7周的第7天，輕輕擠壓大鼠直腸部，分別收集新鮮糞便約2 g于無菌試管中，并立即將試管放入厭氧罐中。

1.3.4酵母菌的分離與鑒定

于10 mL PDA液體培養基中加入1 g大鼠糞便（采集于實驗第1周），富集培養18～24 h，稀釋后采用酸化PDA培養基（用0.1 g/mL的酒石酸水溶液調節滅菌后的PDA培養基至pH 3.5）進行涂布平板法分離，挑取表面光滑的乳白色圓形菌落，進行純化培養，獲得待鑒定菌種[12]。

鑒定流程：待鑒定菌種單個菌落→連續劃線BUY平板→26 ℃培養24～48 h→用無菌純凈水制備菌懸液→濁度計調整濁度為（47±3）% T→接種于YT微孔接種板→26 ℃培養24～48 h→自動微生物鑒定儀讀取鑒定結果。

1.3.5乳桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌的平板培養與計數

取1 g動物糞便于9 mL無菌生理鹽水中勻漿混勻，稀釋梯度為10－1～10－8，根據預實驗結果，選擇適當的3 個稀釋度，分別取0.1 mL稀釋液均勻涂布于相應的平板培養基上，每個稀釋梯度設3 個重復。乳酸桿菌采用MRS培養基在（36±1） ℃厭氧條件下培養48 h后計數；沙門氏菌采用BS培養基（36±1） ℃條件下培養24 h后計數黑色、有金屬光澤菌落；產氣莢膜梭菌采用SPS培養基在（36±1） ℃厭氧條件下培養48 h后計數黑色菌落[13]。

培養后觀察平板上菌落特征，挑取符合3 種腸道菌菌落形態的菌落，進行革蘭氏染色并觀察菌體形態。確定為所需菌種后計數菌落數量，計算每克濕糞便中3 種腸道細菌的活菌數量。

1.3.6調節腸道菌群平衡結果判斷標準

采用方差分析法進行統計分析，根據給予受試物前后各組大鼠腸道菌群值的變化進行評價[14]：1）糞便中雙歧桿菌和（或）乳桿菌增加，產氣莢膜梭菌減少或不增加，擬桿菌、腸桿菌和（或）腸球菌減少或無明顯變化；2）糞便中雙歧桿菌和（或）乳桿菌增加，產氣莢膜梭菌減少或不增加，擬桿菌、腸桿菌和（或）腸球菌明顯增加，但增加幅度低于雙歧桿菌和（或）乳桿菌增加的幅度。符合以上任一標準，并存在顯著差異，即可判定受試物具有調節腸道菌群平衡的作用。

1.3.7菌落總數測定

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]方法進行測定。

1.4數據處理

2　結果與分析

2.1酵母菌分離與鑒定結果

圖1　分離酵母菌M3-ds的菌落形態及革蘭氏染色圖Fig.1 Colony morphology and Gram staining of M3-ds

利用從藏靈菇中篩選的馬克斯克魯維酵母M3菌株制備的凍干菌粉對大鼠進行灌胃實驗后，從大鼠糞便中分離的酵母菌只有M3-ds菌株。由圖1可知，酵母菌M3-ds在PDA培養基上的菌落呈乳白色，微隆起，表面光滑，不透明，有光澤的圓形菌落（圖1A），革蘭氏染色圖顯示其菌體形態（圖1B）與馬克斯克魯維酵母菌M3（圖2）相似（與課題前期實驗結果相同[16]），經微生物快速鑒定儀鑒定為馬克斯克魯維酵母菌，由此進一步證明了藏靈菇源馬克斯克魯維酵母M3具有良好的耐受胃腸道逆環境能力[17]。

圖2　馬克斯克魯維酵母菌M3革蘭氏染色圖Fig.2 Gram staining of M3

2.2藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠體質量的影響

表1　藏靈菇源酵母凍干菌粉對大鼠體質量的影響（x =10）Table 1 Effect of lyophilized Kluyveromyces marxianus from Tibetan kefir on body mass of rats(x ,= 10)

由表1可知，大鼠的體質量隨著喂養時間的延長，低、中、高劑量實驗組大鼠體質量與高脂模型組基本無差異（P＞0.05），表明藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠體質量基本無影響。

2.3藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中乳桿菌數量的影響

±s，n==1100）Table 2 Effect of表2　藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中乳桿菌數量的影響（xf Kluyveromyces marxiannuuss M3 on total lactobacillii count in the intestinal tract of rats(x ± s,,n　=　1100))lg（CFU/g）

在機體腸道內，作為人體和動物腸道內定殖且占絕對優勢的一類生理活性菌，乳酸桿菌可通過產生乳酸、乙酸、過氧化氫等抗菌物質，對維持宿主腸道健康產生有益影響，因此乳酸桿菌數量的增加對維持腸道菌群平衡具有重要作用，且有利于提高機體健康水平[18]。由表2可知，實驗初期4 組大鼠糞便中乳酸桿菌的數量相差無幾。1～3周期間，高脂模型組大鼠糞便中乳酸桿菌的數量隨著大鼠的成長未發生顯著變化，增勢緩慢；3個實驗組乳桿菌的數量呈平緩上升趨勢，增量較為明顯。從第5周測得數據可知，3個實驗組大鼠糞便中乳酸桿菌的數量極顯著（P＜0.01）高于高脂模型組，第5周時低劑量實驗組數量最高，第7周時中劑量實驗組數量最高。這可能是因為實驗的前5周，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3菌株開始在腸道中定殖并大量繁殖至占有一定優勢，5周后開始發揮作用，促進了乳酸桿菌的繁殖。綜上，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3能夠極顯著提高大鼠腸道乳酸桿菌的數量，以低、中劑量效果最為明顯。

2.4藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中沙門氏菌數量的影響

表3　藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中沙門氏菌數量的影響（x =10）Table 3 Effect of Kluyveromyces marxianus M3 on Salmonella count in the intestinal tract of rats(x ,= 10)lg（CFU/g）

在機體腸道微生態失衡時，致病菌如沙門氏菌大量增加，產生毒副作用，引起機體消化機能紊亂，危害機體健康[19]。由表3可知，實驗初期4 組大鼠糞便中沙門氏菌的數量相差不大。前5周時，高脂模型組大鼠糞便中沙門氏菌的數量隨飼喂時間的延長逐漸降低，3 個實驗組的下降趨勢與高脂模型組相比更加明顯。5～7 周時，3 個實驗組大鼠糞便中沙門氏菌的數量極顯著低于高脂模型組（P＜0.01），且低劑量實驗組數量最低。這可能是因為從第5周開始藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3菌株在腸道中定殖、占優勢，對沙門氏菌起到一定的抑制作用，并且隨著時間的增加，腸道中乳酸桿菌數量也逐漸增加，也抑制了沙門氏菌的繁殖。綜上，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3能夠極顯著降低大鼠腸道沙門氏菌的數量，且低劑量效果最為明顯。

2.5藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中產氣莢膜梭菌數量的影響

表4　藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3對大鼠腸道中產氣莢膜梭菌數量的影響（x ±s，n==1100）Table 4 Effect ofnus M33　oonn　Clostriddiiuumm perfrinnggeennss count in the intestinal tract of rats(xf Kluyveromyces marxianus ± s,,n　=　1100))lg（CFU/g）

在機體腸道內，產氣莢膜梭菌屬于致病菌，可分泌外毒素，引起胃腸道壞死性病變，若其數量達到一定水平，不利機體健康[20]。由表4可知，實驗初期4 組大鼠糞便中氣莢膜梭菌的數量差別不明顯。前5 周，高脂模型組大鼠糞便中產氣莢膜梭菌的數量隨飼喂時間的延長逐漸降低；第5～7周期間，低劑量實驗組大鼠糞便中產氣莢膜梭菌的數量顯著低于高脂模型組（P＜0.05）。這應該是因為第5周后，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3菌株一方面選擇性地增加了有益菌乳酸桿菌的數量；另一方面，抑制了產氣莢膜梭菌的生長。綜上，藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3能夠顯著降低實驗組大鼠產氣莢膜梭菌的數量，且以低劑量效果尤為明顯。

3　討 論

機體腸道正常菌群失衡會造成腸道功能紊亂，對機體正常代謝和抗感染能力有影響，易引發腸道感染，出現便秘、腹瀉等癥狀。維持腸道菌群平衡，對保持機體健康水平具有重要意義[21]。

Xie Yuanhong等[22]研究表明，高膽固醇血癥模型建立成功時，高脂模型組大鼠血清膽固醇和甘油三酯水平較高，肝功能紊亂，肝臟組織病理切片表明肝臟發生病變；而實驗組大鼠血清膽固醇和甘油三酯基本保持在正常水平，肝臟組織病理切片正常，肝臟未發生病變。當肝臟發生病變時，脂質代謝紊亂，肝細胞膽汁排泌減少，腸道清除、排空能力降低，腸道抗體、溶菌酶、黏液分泌減少，腸壁局部抵抗力下降，使得有害菌數量增長甚至占優勢，造成嚴重的腸道菌群失衡。

通過對大鼠糞便中3 種具有代表性的腸道菌群，即乳酸桿菌（有益菌）、沙門氏菌（致病菌）和產氣莢膜梭菌（致病菌）的活菌數量的測定，根據受試物調節腸道菌群平衡結果判斷標準，可判定藏靈菇源克魯維酵母菌M3對大鼠具有調節腸道菌群平衡的作用。這是因為藏靈菇源馬克斯克魯維酵母菌M3具有良好的耐受胃腸道逆環境特性[18]，能夠定殖在腸道中，并大量繁殖占有一定優勢，使腸道中有益菌數量上升，有害菌數量下降，從而起到調節腸道菌群平衡的效果；同時，藏靈菇源克魯維酵母菌M3產生高活力的膽鹽水解酶，能有效降低血清總膽固醇（total choleiterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）的含量，從而減緩機體肝臟組織病變，維持腸道正常生理功能，使有害菌數量不占優勢，亦起到調節腸道菌群平衡的功效。

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Regulatory Effect of Kluyveromyces marxianus M3 Isolated from Tibetan Kefir on the Intestinal Flora Balance in Rats

DONG Muqun1,XIONG Lixia1,XIE Yuanhong1,ZHANG Hongxing1,LIU Hui1,*,JIA Hui1,LIAN Zhengxing2
(1.Beijing Engineering Laboratory of Key Technology Development of Microecologics,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China; 2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100091,China)

Abstract:To evaluate the effects ofKluyveromyces marxianus M3,with good fermentation performance and high ability to produce bile salt hydrolase,isolated from Tibetan kefir on the intestinal flora balance in experimental hypercholesterolemic rats,40 rats(43 weeks old)were divided into 4 groups and fed a high fat diet supplemented with low,medium and high dose of freeze-dried K.marxianus M3 powder for a 7-week experimental period.According to our results,in the first five weeks,the numbers of 3 kinds of bacteria in rat feces gradually changed,and there was no significant difference between the three experimental groups and the high-fat model group; at the fifth week,the preventive hypercholesterolemia model was established successfully,the number of Lactobacillus in the three experimental groups was significantly higher than that in the high-fat model group(P < 0.01),while the number of Salmonella(P < 0.01)and Clostridium perfringens(P < 0.05)was significantly lower than in the high-fat model; among all experimental groups,the number of Lactobacillus in the low dose group was the highest while Salmonella and Clostridium perfringens were the lowest,showing that the effect of low dose was better than the medium and high doses.These results demonstrated that K.marxianus M3 could promote the growth of intestinal beneficial bacteria and inhibit the breeding of harmful bacteria in the hypercholesterolemic rats,having a good effect on the intestinal flora balance.

Key words:Tibetan kefir; Kluyveromyces marxianus; animal experiment; intestinal flora balance

中圖分類號：book=198,ebook=205Q93.337

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0197-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605035 10.7506/spkx1002-6630-201605035.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：劉慧（1963—），女，教授，碩士，研究方向為食品微生物與發酵。E-mail：foodlh@263.net

作者簡介：董牧群（1989—），女，碩士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：dmqtc@sina.com

基金項目：北京市自然科學基金項目（5092008）；國家轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08008-005）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養項目（CIT&TCD20140315）

收稿日期：2015-10-31