血清基質金屬蛋白酶-9水平及其基因多態性與頸動脈斑塊易損性的相關

董　翔　常　庚　陶定波

(大連醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧　大連　116011)

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血清基質金屬蛋白酶-9水平及其基因多態性與頸動脈斑塊易損性的相關

董翔常庚陶定波

(大連醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧大連116011)

〔摘要〕目的探討基質金屬蛋白酶(MMP)-9血清水平及其基因多態性與頸動脈斑塊易損性之間的相關性。方法選取2011年3月至2013年4月在大連醫科大學附屬第一醫院神經內科住院治療且發病時間在48 h之內的腦梗死患者271例，根據B超檢查結果，分為斑塊穩定組和斑塊易損組，利用酶聯免疫吸附法對兩組患者血清MMP-9水平進行檢測，采用PCR-酶切反應過程對MMP-9基因多態性進行測定。結果斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩定組(P<0.05)；斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組T/T和C/T基因型頻率高于斑塊穩定組，斑塊易損組與斑塊穩定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI 1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩定組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩定組T/C的OR=1.56(95%CI 1.07～2.83，P<0.05)。結論MMP-9血清水平及其基因多態性與頸動脈斑塊易損性密切相關，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點多態性測定作為臨床患者頸動脈斑塊易損性判斷的早期標志物。

〔關鍵詞〕基質金屬蛋白酶-9；基因多態性；頸動脈斑塊；腦梗死

腦梗死是嚴重危害老年人群健康的腦血管疾病，嚴重影響老年患者及家屬生活質量〔1〕，早期發現腦梗死高危因素并采取積極的預防措施，對于減少腦梗死發生及改善患者預后具有十分重要的意義。研究表明〔2,3〕，頸動脈粥樣硬化是腦血管疾病的獨立危險因素，頸動脈斑塊的易損性是引發腦梗死的重要潛在危險因素和病理基礎。因此，積極尋找影響頸動脈斑塊易損性的可能因素顯得尤為重要。基質金屬蛋白家族(MMPs)是一種鈣鋅離子依賴性蛋白酶超家族，主要在細胞外基質(ECM)降解中發揮作用，有研究指出〔4,5〕，MMPs可以通過破壞斑塊結構和纖維帽成分而造成斑塊加速破裂，從而影響斑塊的穩定性。MMP-9是MMPs家族較為重要的成員之一，有研究報道〔6〕，粥樣斑塊內MMP-9呈現高表達。本研究通過探討腦梗死患者頸動脈穩定性和易損性斑塊患者之間MMP-9血清水平的差異，進一步從基因水平上分析MMP-9基因多態性與頸動脈斑塊易損性之間的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年3月至2013年4月在大連醫科大學附屬第一醫院神經內科住院治療且發病時間在48 h之內的腦梗死患者271例，所有患者均行頸動脈B超檢查，根據檢查結果，參照文獻報道中關于頸動脈斑塊分類標準〔7〕：①斑塊穩定組：B超下示頸動脈呈高回聲，共計147例，男91例，女56例，平均年齡(64.7±13.4)歲；②斑塊易損組：B超下示頸動脈斑塊呈低回聲，共計124例，男79例，女45例，平均年齡(66.3±11.7)歲。所有患者均符合中華醫學會神經學會關于腦梗死的診斷標準〔8〕，同時排除腦動脈炎、心源性腦梗死等其他原因導致的腦梗死，并發重要臟器衰竭的患者和嚴重全身感染者，以及患有惡性腫瘤和近2個月有服用降脂藥物或抗血小板治療等藥物史者。所有研究對象均進行了知情同意。

1.2臨床資料收集記錄患者性別、年齡、血壓、體重指數(BMI)、吸煙史等基本資料，并于入院第2日抽取患者晨起空腹血9 ml，分裝3支試管，5 ml用于生化檢查，采用日立7600-020型全自動生化儀對患者空腹血糖(Glu)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進行檢測；另外兩支試管各2 ml，一管用于基因組DNA抽取，另一管用于MMP-9血清含量檢測，兩者均凍存于-80℃冰箱備用。所有患者均采用彩色多普勒超聲儀對雙側頸總動脈內中膜厚度(IMT)進行檢測，IMT≥1.25 mm定義為粥樣斑塊。

1.3檢測試劑人MMP-9酶聯免疫吸附測定試劑盒購自廈門慧嘉生物，用于血清MMP-9血清水平檢測；Pfu DNA聚合酶購自美國Invitrogen公司，Tris飽和酚購自北京華越洋生物，限制性內切酶PaeI及其緩沖液購自美國MBI公司，PCR純化試劑盒購自上海華工生物，并由上海華工生物完成DNA測序。

1.4MMP-9多態性檢測

1.4.1DNA的提取利用低滲溶血-酚法由白細胞中提取，利用KY009核酸蛋白測定儀對DNA進行檢測，確定提取的濃度，并根據A260/A280值確定PCR擴增模板。

1.4.2聚合酶鏈反應(PCR)擴增MMP-9啟動子區-1562C/T位點及其側翼區，上游引物A為：5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物B為：5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，擴增產物為435 bp，反應條件為緩沖液2.5 μl×10，dNTP(分別10 mmol/L)0.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Pfu DNA聚合酶2 U，加RNase-Free Water至總體積達到25 μl。反應條件：95℃預變性120 s；94℃變性45 s；65℃退火70 s；72℃延伸90 s，反復循環34次，最終72℃延伸600 s。

1.4.3酶切反應過程采用限制性內切酶PaeI對純化后的PCR產物進行酶切，反應體系包括：1 μg PCR產物，緩沖液2 μl×10，內切酶PaeI 2.5 U，加RNase-Free Water至總體積達到20 μl，放置37℃水浴箱，進行酶切16 h，反應產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，進行溴乙啶(EB)染色，使用凝膠成像系統對結果進行判定。

1.5統計學處理基因頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，P>0.05，說明符合H-W遺傳平衡定律，具有良好的代表性。采用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗，相對危險度采用OR及其95%可信區間(CI)表示。

2結果

2.1兩組患者基本情況比較兩組患者基本情況進行比較發現，兩組性別、年齡、BMI、血壓、Glu、血脂等基本情況差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　斑塊穩定組和斑塊易損組一般情況比較±s)

2.2不同組患者血清MMP-9水平情況斑塊易損組患者血清MMP-9水平為(24.3±9.1)μg/L，明顯高于斑塊穩定組〔(19.4±0.7)μg/L，t=3.821,P<0.001〕。

2.3MMP-9基因多態性分析結果采用PCR-酶切法對MMP-9基因多態性進行分析，利用PaeI內切酶對PCR產物進行酶切，如果為野生型純合子(基因型C/C)，沒有出現突變，則不能被酶切，只出現一條435 bp的帶；如果為突變型純合子(基因型T/T)，C完全突變為T，則完全被酶切，出現247 bp和188 bp兩條帶；如果為突變雜合子(基因型C/T)，則被部分酶切，出現435 bp、247 bp和188 bp三條帶，見圖1。

M：Marker；1、4、5：突變型純合子T/T；2：野生型純合子C/C；3：突變雜合子C/T圖1　MMP-9基因多態性酶切產物凝膠電游圖

2.4兩組患者基因型分布和等位基因分布情況比較斑塊穩定組和斑塊易損組患者MMP-9基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.151，P=0.922；χ2=1.327，P=0.159)，說明群體代表性較好。斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩定組T/C的OR=1.56(95%CI1.07～2.83，P<0.05)，見表2。

表2　兩組患者MMP-9不同基因型頻率和等

3討論

越來越多的研究表明〔9,10〕，急性腦梗死的發生與頸動脈斑塊的穩定性有關，頸動脈斑塊的易損破裂是造成腦梗死發生的直接原因。細胞外基質是血管壁主要成分，可以保持斑塊的完整性，同時含有膠原物質，能夠保持彈性與韌性，在防止斑塊破裂方面發揮重要作用，當細胞外基質被過度講解時，將增加斑塊的易損性，導致斑塊破裂。MMP-9主要參與膠原、彈性蛋白和纖維蛋白等的降解，可以破壞斑塊的穩定性，增加斑塊易損性，在斑塊破裂過程中發揮重要作用〔11〕。本研究提示MMP-9參與ECM的降解，與斑塊的穩定性有關。

MMP-9基因位于人染色體20q1 1.2～13.1，在其4個啟動子區多態性中，-1562C/T位點變異可能與基因轉錄相關，當發生C→T突變后，可以產生低活性C/C和高活性C/T、T/T啟動子基因，其中，C/T、T/T啟動子基因可以引發MMP-9的高表達〔12〕，因此，MMP-9基因多態性決定了人群對某種疾病的遺傳易感性。本研究說明易損斑塊MMP-9基因發生了基因突變，(TT+CT)/CC比例增高增加了斑塊損傷的危險性，高活性啟動子基因大量產生，使MMP-9表達增多，從而進一步加速斑塊的破損。斑塊易損組T基因頻率遠高于斑塊穩定組，說明在易損斑塊組發生了C→T突變，產生高活性的啟動子基因型，使MMP-9高表達，進一步破壞斑塊的穩定性。從基因水平也解釋了斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩定組的原因。

綜述所述，MMP-9血清水平及其基因多態性與頸動脈斑塊易損性密切相關，其中，-1562C/T位點是頸動脈斑塊易損性的易感基因，其多態性直接影響斑塊的穩定性。因此，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點多態性測定作為臨床患者頸動脈斑塊易損性判斷的早期標志物，對其危險性進行評估，進而早期發現易感人群，開展早期的干預，預防頸動脈斑塊易損性的發生，進而降低腦梗死的發生率。

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〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1344-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.028

通訊作者：常庚(1981-)，男，副主任醫師，博士，主要從事癡呆研究。

第一作者：董翔(1975-)，男，副主任醫師，博士，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。