趨化素樣因子1在大鼠腹主動脈瘤病情發展中的作用

莊　暉　郭平凡　詹騰輝

(福建醫科大學附屬第一醫院血管外科，福建　福州　350005)

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趨化素樣因子1在大鼠腹主動脈瘤病情發展中的作用

莊暉郭平凡詹騰輝

(福建醫科大學附屬第一醫院血管外科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探討氫氣抑制趨化素樣因子1(Cklf1)在大鼠腹主動脈瘤病情發展中的作用。方法取雄性SD大鼠20只，隨機分為腹主動脈瘤組和腹主動脈瘤干預組(腹腔注射氫氣飽和生理鹽水)，建立腹主動脈瘤模型。術后28 d開腹取材，觀察腹主動脈擴張情況，采用蘇木素-伊紅(HE)染色和彈力纖維染色檢測炎癥浸潤和腹主動脈中膜彈力纖維破壞情況，免疫組化法檢測Cklf1(rCklf1)、金屬蛋白酶(MMP2)蛋白表達情況，RT-PCR檢測rCklf1、MMP2基因表達情況。結果腹主動脈瘤組大鼠腹主動脈擴張率明顯高于腹主動脈瘤干預組(P<0.01)。腹主動脈瘤組大鼠瘤壁rCklf1 mRNA、MMP2 mRNA表達量均明顯高于腹主動脈瘤干預組(P<0.01)；rCklf1、MMP2主要在腹主動脈瘤壁中層病變嚴重區域表達上調；與腹主動脈瘤組相比，干預組rCklf1、MMP2陽性表達明顯減弱，炎癥浸潤、彈力纖維破壞程度明顯減輕。結論氫氣可通過抑制rCklf1表達，抑制炎性細胞向腹主動脈受損區域聚集，降低MMP2表達合成，減緩中膜彈力纖維降解，干預腹主動脈瘤進展。

〔關鍵詞〕腹主動脈瘤；趨化素樣因子1

腹主動脈瘤為老年性疾病之一，多數在動脈硬化基礎上發生。趨化素樣因子1(Cklfl)具有趨化因子的結構特征和功能。相關研究顯示，腹主動脈瘤體組織中趨化因子表達明顯增強，在病情進展中能夠準確調控白細胞向炎性組織遷移〔1〕。已有研究顯示，氫氣可成為一種新的治療炎性疾病的特效藥物，其主要機制為抑制趨化因子表達〔2〕。本研究擬探究大鼠Cklfl(rCklf1)在受氫氣飽和生理鹽水干預后對腹主動脈瘤進展的影響。

1 材料與方法

1.1動物與試劑SPF級雄性SD大鼠，購于北京華阜康生物科技股份有限公司；氫氣飽和生理鹽水購于濟南紅杉樹健康科技有限公司；兔源rCklf1多克隆抗體由中國醫科大學贈予；兔源基質金屬蛋白酶(MMP)2購于上海鈺博生物科技有限公司；Trizol試劑購于江蘇溥博生物科技有限公司；逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶、通用引物Oligo(dT)Primer購于賽默飛世爾科技有限公司；引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2方法①實驗分組：取雄性SD大鼠20只，體質量190～210 g，根據體質量編號，隨機分為腹主動脈瘤組和腹主動脈瘤干預組，每組10只。其中腹主動脈瘤干預組大鼠腹腔注射氫氣飽和生理鹽水6 ml·kg-1·d-1；腹主動脈組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水；上述注射操作從造模成功日起到取動脈瘤組織日結束，注射1次/d。②建模和標本采集：腹主動脈瘤模型建立完全按照Lenburg等〔3〕研究的方法。從造模成功后第28天，打開大鼠腹腔，分離腹主動脈段，取其中一半長度置于4%甲醛溶液中固定，進行蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化染色、特殊染色。余下的另一半置于-80℃冰箱中，用于RT-PCR檢測。③指標檢測：腹主動脈直徑測量完全按照Chiou等〔4〕研究方法；rCklf1和MMP2 mRNA相對定量檢測中RCR引物：rCklf1上游引物：5′ACGCCGCGCCTCCCAGAATT3′；下游引物：5′ACGAGAGGTCCTGAGCGCGT3′。MMP2上游引物：5′CGACTATGACTGTGACCATGAC3′；下游引物：5′GTTAGAAAAGACCCTCGAGATG3′。

1.3統計學分析采用SPSS18.0軟件進行t檢驗及Pearson相關分析。

2結果

2.1大鼠腹主動脈瘤大體形態造模后大鼠腹主動脈最大直徑較造模前增加50%以上可診斷為腹主動脈瘤，本研究兩組大鼠均達到該診斷標準，成瘤率100%。腹主動脈瘤組大鼠腹主動脈擴張率為(163±34)%，明顯高于腹主動脈瘤干預組大鼠的(85±39)%(t=18.299，P=0.000)。

2.2HE染色和彈力纖維染色HE染色顯示腹主動脈瘤組大鼠動脈血管壁結構破壞、厚度增加，平滑肌細胞排列不整，多數炎性細胞浸潤；腹主動脈瘤干預組大鼠動脈血管壁結構完整、厚度無明顯改變，平滑肌分布整齊，炎性細胞數量明顯多于腹主動脈瘤組。彈力纖維染色顯示，腹主動脈瘤組大鼠動脈中膜彈力纖維層次不清，形態無規律，層數減少，存在碎片、斷裂，無原有的連續性和曲度；腹主動脈瘤干預組大鼠彈力纖維總體結構較為完整，層次清晰，連續性和曲度較好，見圖1，圖2。

2.3免疫組化染色分別進行免疫組化rCklf1、MMP2特異性蛋白染色，腹主動脈瘤組大鼠動脈瘤組織結構顯示強陽性棕黃色染色，rCklf1、MMP2高表達多分布在動脈瘤管壁中層碎片、斷裂等病變嚴重區域；腹主動脈瘤干預組rCklf1、MMP2表達均呈現弱陽性，見圖3、圖4。

圖1　術后28 d兩組腹主動脈HE染色(×400)

圖2　術后28 d兩組腹主動脈彈力纖維染色(×400)

圖3　術后28 d兩組腹主動脈rCklf1染色(×400)

圖4　術后28 d兩組腹主動脈MMP2染色(×400)

2.4RT-PCR檢測結果rCklf1 mRNA在腹主動脈瘤組動脈瘤組織中相對含量(4.90±0.47)明顯高于腹主動脈瘤干預組(1.45±0.30)(t=18.399，P=0.000)；MMP2在腹主動脈瘤組動脈瘤組織中相對含量(11.39±0.52)明顯高于腹主動脈瘤干預組(3.57±0.86)(t=16.359，P=0.000)。rCklf1 mRNA與MMP2 mRNA變化之間呈明顯正相關(r=0.840，P=0.006)。

3討論

炎癥參與了腹主動脈瘤發病，其中趨化因子調控淋巴細胞和單核巨噬細胞的活化、轉移是啟動腹主動脈瘤發病的關鍵〔5〕。相關研究發現，腹主動脈瘤血管組織中趨化因子明顯高表達，在趨化因子的引導下血液中淋巴細胞和巨噬細胞浸潤于動脈血管壁，分泌出大量MMP，促使動脈管壁中包括膠原蛋白、彈力蛋白等在內的結構蛋白降解，損傷膠原纖維和彈力纖維，其中彈力纖維受損在腹主動脈瘤形成過程中具有重要地位〔6,7〕。Cklfl在體內和體外均對淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞有明顯的趨化活性，與動脈硬化、內膜增生等炎癥進程有明顯關聯。考慮到Cklfl的特殊結構和功能，我們推測Cklfl可能參與了腹主動脈瘤發病。氫氣對所有嚴重相關疾病均具有較好的療效，主要機制為抑制趨化因子的表達。在內毒素誘導急性肺損傷大鼠中，氫氣可通過下調趨化因子表達，來緩解組織中炎性細胞聚集，減輕炎癥對機體組織的傷害〔8〕。

本文提示，在腹主動脈瘤形成早期可采用藥物、基因等治療手段抑制Cklfl的表達，還可使用Cklfl受體競爭性抑制劑來干預動脈瘤的形成過程。此外，氫氣能夠有效干預腹主動脈瘤進程，在倫理委員會批準后，可進行多中心試驗來驗證氫氣抑制腹主動脈瘤。臨床上對于瘤體直徑>5.5 cm的大腹主動脈瘤，應盡早行動脈瘤切除術治療；但80%以上的腹主動脈瘤直徑<5.5 cm，外科手術治療風險高于收益，對于此類患者只能通過定期隨訪檢測瘤體變化，待直徑>5.5 cm時給予手術治療。

4參考文獻

1鄭梓煜，葉子，黃應雄，等.腹主動脈瘤破裂的預后影響因素分析〔J〕.中華急診醫學雜志，2014；23(11)：1253-8.

2王宏穎，包學英，王璐，等.腸癌患者腸道菌群中大腸埃希菌攜帶β-葡萄糖醛酸酶基因的鑒定與特征〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(3)：332-4.

3Lenburg JC，Simioneseu DT，Stareher BC，etal.ElastJn stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms〔J〕.Circulation，2007；115(23)：1729-37.

4Chiou AC，Chiu B，Pearce WH.Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride〔J〕.J Surg Res，2001；99(11)：371-6.

5屈碧輝，蔡威，何濤，等.腹主動脈瘤患者外周血CD19+CD24 hi CD38 hi B細胞功能變化〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(14)：3841-3.

6裴華偉，常謙.間充質干細胞在腹主動脈瘤治療應用中作用機制的研究進展〔J〕.中國循環雜志，2014；29(8)：653-5.

7Zhang Y，Sun Q，He B，etal.Anti-inflammatory effect of hydrogen-rich saline in a rat model of regional myocardial ischemia and reperfusion〔J〕.Int J Cardiol，2011；148(39)：91-5.

8李靖華，林曉東，粟海霞，等.腹主動脈瘤與CD40的關系〔J〕.中華實驗外科雜志，2015；32(2)：271-3.

〔2015-07-10修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

〔中圖分類號〕R65

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1287-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.003

基金項目：福建省自然科學基金(No.2014J01323)

第一作者：莊暉(1978-)，男，碩士，主治醫師，主要從事下肢血管疾病、內臟血管疾病、主動脈疾病及血管畸形研究。