萊菔硫烷對阿爾茨海默病大鼠海馬超微結構和白介素-1β水平的影響

孟鑫雨　費洪新　王少東　趙瑤潔　王曉源　羅麗娜　劉　旭　彭東軍　周忠光　李寶龍

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江　哈爾濱　150040)

?

·基礎研究·

萊菔硫烷對阿爾茨海默病大鼠海馬超微結構和白介素-1β水平的影響

孟鑫雨費洪新1王少東趙瑤潔王曉源羅麗娜劉旭彭東軍周忠光李寶龍

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

〔摘要〕目的探討萊菔硫烷(SFN)對阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬超微結構和白介素(IL)-1β水平的影響。方法42只Wistar大鼠隨機分成對照組，模型組，治療組(吡拉西坦430 mg/kg)，SFN高、中、低劑量組(SFN 40，20，10 mg/kg)。采用Aβ(1～42)雙側腦室注射大鼠誘導建立AD模型。給予SFN連續灌胃治療35 d后取材，觀察大鼠海馬鏡下超微結構、計算脾和胸腺臟器指數，采用雙抗體夾心法測定海馬組織IL-1β水平。結果與模型組比較，SFN高、中劑量組腦海馬形態明顯改善，脾和胸腺臟器指數明顯增加(P<0.05)，海馬組織IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。結論SFN能改善AD大鼠海馬形態結構，增加脾和胸腺臟器指數，降低海馬組織IL-1β水平。

〔關鍵詞〕萊菔硫烷；阿爾茨海默病；超微結構

阿爾茨海默病(AD)是臨床上常見的老年性疾病之一，目前抗AD的藥物僅僅是短暫改善AD患者的癥狀，對AD病情的發展并沒有較大的影響〔1〕。中藥材西蘭花、芥藍、花椰菜等植物中含有萊菔硫烷(SFN)。SFN又稱為蘿卜硫素，分子式為C6H11S2NO，具有內源性抗氧化〔2〕、抗視網膜缺血再灌注損傷〔3〕、抑制前列腺癌DU145細胞增殖〔4〕、改善線粒體功能〔5〕、預防精神病發作〔6〕、保護AD大鼠膽堿能神經元〔7〕等功能，但SFN對Aβ1～42誘導AD大鼠模型的研究國內外尚無文獻報道。本實驗擬觀察SFN對AD大鼠超微結構、臟器指數和白介素(IL)-1β的影響，以期為防治AD奠定基礎。

1材料和方法

1.1動物雄性清潔級Wistar大鼠42只，體重(230±20)g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心李寶龍副主任提供，質量合格證書號：SCXK(黑)2013-012。Wistar大鼠飼養在常溫、常濕的屏障動物實驗設施環境中，給予Wistar大鼠無菌的飼料和蒸餾水，自由攝取食物、分籠飼養。

1.2藥品和試劑吡拉西坦(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號5140556)，IL-1β酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20140401)，Aβ1～42和D-半乳糖(Sigma公司)，SFN(LKT公司)；其他試劑均為國產分析純，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心李寶龍副主任提供。

1.3儀器TCNAI-G2型透射電鏡(荷蘭公司)，TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，Leica-2135切片機(德國Leica公司)，電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)，6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)，STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)等。

1.4復制AD模型大鼠水合氯醛麻醉后，固定大鼠，剪去大鼠頭頂部毛發，暴露頂骨，STW-1型腦立體定位儀定位大鼠海馬區，微量加樣器向雙側腦室海馬區一次性注入10 μg凝聚態Aβ1～42(2 μg/μl)，針頭留置15 min，緩慢退針，骨蠟封閉，包扎大鼠頭部，預防感染。對照組大鼠雙側腦室注射等量生理鹽水。

1.5分組及給藥Wistar大鼠按照隨機數字表隨機分為對照組、模型組、治療組、SFN高劑量組、SFN中劑量組、SFN低劑量組，每組7只，共42只。對照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，治療組給予吡拉西坦430 mg/kg灌胃，SFN高、SFN中、低劑量組分別給予40、20、10 mg/kg灌胃，持續35 d。

1.6透射電鏡觀察腦組織海馬大鼠末次給藥2h后，水合氯醛麻醉，剪開腹腔、胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，針頭插入左心室，向左心室緩慢灌注200ml生理鹽水。肝臟變白后，用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠腦組織海馬部位、2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等過程，TCNAI-G2型透射電鏡觀察大鼠腦組織海馬CA3區結構。

1.7測定脾和胸腺臟器指數大鼠斷頭處死，冰上迅速解剖，取材大鼠脾和胸腺，用生理鹽水將臟器清洗干凈，洗去殘余的血液，用電子天平精確稱取大鼠脾和胸腺的臟器質量，計算臟器指數。臟器指數(mg/g)=臟器質量(mg)/體重(g)。

1.8檢測海馬白介素(IL)-1β含量大鼠斷頭迅速取海馬組織，勻漿，4℃靜置1 h，TGL-16G臺式離心機4 000 r/min離心30 min，分裝，-80℃冰箱保存備用。按說明書進行操作，使用6100型RT-雷杜酶標儀于450 nm波長處測定各孔吸光度(A)。根據標準曲線方程求出海馬組織IL-1β的含量。

1.9統計學分析采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1SFN對AD大鼠腦海馬CA3區超微結構的影響

2.1.1SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元超微結構的影響對照組大鼠海馬CA3區神經元形態規則，細胞核橢圓形，細胞質豐富，細胞核和細胞質的比例正常，核膜清晰；模型組大鼠海馬CA3區神經元形態不規則，細胞核扁圓形，細胞質較少，核染色質邊集，核膜不清楚；治療組、SFN高、中和低劑量組大鼠海馬CA3區神經元形態較規則，細胞質內的細胞器不同程度地增加。見圖1。

2.1.2SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元細胞質超微結構的影響對照組大鼠海馬CA3區神經元細胞質比較豐富，可以見到雙層核膜，核膜清晰，粗面內質網較多，模型組大鼠海馬CA3區神經元細胞質較少，內外層核膜不清楚，粗面內質網較少；治療組、SFN高、中和SFN低劑量組大鼠海馬CA3區神經元細胞質內的細胞器不同程度地增加，核膜較清晰。見圖2。

2.1.3SFN對AD大鼠腦海馬CA3區毛細血管超微結構的影響對照組大鼠海馬CA3區毛細血管形態規則，內皮細胞核扁圓形，管腔內可見紅細胞；模型組大鼠海馬CA3區毛細血管形態不規則，細胞核不清晰，細胞質較少，毛細血管管壁較厚且分層不清晰；治療組、SFN高和中劑量組大鼠海馬CA3區毛細血管形態較為規則，內皮細胞清晰，說明SFN高、中劑量對AD大鼠海馬CA3區毛細血管有改善作用；SFN低劑量組大鼠海馬CA3區毛細血管管壁結構分層不清晰，內皮細胞結構不清晰。見圖3。

2.1.4SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元突觸超微結構的影響對照組大鼠海馬CA3區神經元突觸豐富，突觸不融合；模型組大鼠海馬CA3區神經元突觸較少，突觸間隙不清楚，突觸融合；治療組、SFN高、中和SFN低劑量組大鼠海馬CA3區神經元突觸不同程度地增加。見圖4。

A：對照組；B：模型組；C：治療組；D：SFN高劑量組；E：SFN中劑量組；F：SFN低劑量組；下圖同圖1　SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元超微結構的影響(透射電鏡，×2 550)

圖2　SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元細胞質超微結構的影響(透射電鏡，×11 500)

圖3　SFN對AD大鼠腦海馬CA3區毛細血管超微結構的影響(透射電鏡，×11 500)

圖4　SFN對AD大鼠腦海馬CA3區神經元突觸超微結構的影響(透射電鏡，×20 500)

2.2SFN對AD大鼠脾和胸腺臟器指數的影響與對照組相比，模型組大鼠脾和胸腺臟器指數明顯降低(P<0.05)；經過治療后，與模型組比較，治療組、SFN高、中劑量組脾和胸腺臟器指數明顯升高(P<0.05)；而與模型組比較，低劑量組脾和胸腺臟器指數改變不明顯(P>0.05)。見表1。

表1　SFN對AD大鼠脾和胸腺臟器指數的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3SFN對AD大鼠腦海馬IL-1β含量的影響與對照組〔(235.16±39.05)pg/ml〕比較，模型組大鼠海馬組織IL-1β含量〔(385.34±53.39)pg/ml〕明顯升高(P<0.05)；經過治療后，與模型組比較，治療組〔(262.82±62.73)pg/ml〕、SFN高劑量組〔(286.33±66.00)pg/ml〕、SFN中劑量組〔(295.64±70.47)pg/ml〕大鼠海馬組織IL-1β含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組大鼠海馬組織IL-1β的含量〔(347.73±79.83)pg/ml〕改變不明顯(P>0.05)。

3討論

AD神經元病變的區域主要集中在海馬、皮質等〔8〕。海馬結構主要分為CA1區、CA2區、CA3區和DG區，其中CA3區與學習記憶關聯度較大〔9〕。國外的學者較多采用海馬區域注射Aβ1～42誘導AD模型〔10～12〕，國內的研究者多采用海馬區域注射Aβ1～42及腹腔注射D-半乳糖建立AD模型〔13〕。本實驗說明SFN可以改善AD大鼠海馬CA3區的超微結構。

外周免疫器官脾臟產生大量的B細胞和巨噬細胞，B細胞可以轉化為漿細胞，漿細胞分泌抗體，參與機體的體液免疫；而中樞免疫器官胸腺可產生大量的T細胞和胸腺素，提示其可參與機體的細胞免疫。脾臟和胸腺的相對質量增加或者減少可間接顯示機體免疫功能的增強或者減弱。本實驗提示模型組大鼠脾和胸腺相對質量減輕，說明模型組大鼠B細胞和T細胞數量減少，提示模型組免疫功能降低。SFN可以增加脾臟和胸腺的相對質量，增加機體的免疫功能，而說明低劑量SFN對AD大鼠的免疫功能影響不明顯。

在AD中β淀粉樣蛋白可以激活小膠質細胞，活化的小膠質細胞分泌IL-1β，IL-1β可以作用于小膠質細胞，促進小膠質細胞的增殖，從而釋放更多的IL-1β；另外，IL-1β可以作用于星形膠質細胞的IL-1β受體，促進星形膠質細胞產生更多的炎癥介質，參與機體腦組織無菌性的炎癥反應。本實驗模型組大鼠海馬區域無菌性炎癥反應明顯。SFN高、中劑量可以改善腦組織海馬的神經性炎癥反應，但低劑量SFN對大鼠海馬區域IL-1β水平的影響不明顯。本實驗顯示IL-1β的變化趨勢與AD大鼠海馬CA3區結構、脾指數和胸腺指數的變化趨勢相互關聯，大鼠海馬IL-1β含量降低可伴隨著大鼠海馬CA3區結構改善，說明SFN可以通過降低大鼠海馬IL-1β含量來改善大鼠海馬的超微結構。

綜上所述，SFN可以改善AD大鼠海馬CA3區超微結構，增加AD大鼠脾指數和胸腺指數，增強AD大鼠的免疫功能，減輕AD大鼠的癥狀，保護AD大鼠腦組織超微結構，SFN防治AD的機制與降低海馬IL-1β含量有關。

4參考文獻

1Sugino H，Watanabe A，Amada N，etal.Global trends in alzheimer disease clinical development：increasing the probability of success〔J〕.Clin Ther，2015；37(8)：1632-42.

2Li B，Tian S，Liu X，etal.Correction：sulforaphane protected the injury of human vascular endothelial cell induced by LPC through up-regulating endogenous antioxidants and phase Ⅱ enzymes〔J〕.Food Funct，2015；6(8)：2862.

3Ambrecht LA，Perlman JI，McDonnell JF，etal.Protection of retinal function by sulforaphane following retinal ischemic injury〔J〕.Exp Eye Res，2015；138(1)：66-9.

4Peng X，Zhou Y，Tian H，etal.Sulforaphane inhibits invasion by phosphorylating ERK1/2 to regulate E-cadherin and CD44v6 in human prostate cancer DU145 cells〔J〕.Oncol Rep，2015；34(3)：1565-72.

5Lavich IC，De Freitas BS，Kist LW，etal.Sulforaphane rescues memory dysfunction and synaptic and mitochondrial alterations induced by brain iron accumulation〔J〕.Neuroscience，2015；301(5)：542-52.

6Shirai Y，Fujita Y，Hashimoto R，etal.Dietary intake of sulforaphane-rich broccoli sprout extracts during juvenile and adolescence can prevent phencyclidine-induced cognitive deficits at adulthood〔J〕.PLoS One，2015；10(6)：e0127244.

7Zhang R，Zhang J，Fang L，etal.Neuroprotective effects of sulforaphane on cholinergic neurons in mice with Alzheimer's disease-like lesions〔J〕.Int J Mol Sci，2014；15(8)：14396-410.

8Rossi L，Mazzitelli S，Arciello M，etal.Benefits from dietary polyphenols for brain aging and Alzheimer's disease〔J〕.Neurochem Res，2008；33(12)：2390-400.

9Folstein M，Folstein S.Functional expressions of the aging brain〔J〕.Nutr Rev，2010；68(2)：S70-73.

10Liu H，Deng Y，Gao J，etal.Sodium hydrosulfide attenuates beta amyloid induced cognitive deficits and neuroinflammation via modulation of MAPK/NF-κB pathway in rats〔J〕.Curr Alzheimer Res，2015；12(7)：673-83.

11Yang H，Wang S，Yu L，etal.Esculentoside A suppresses Aβ1～42-induced neuroinflammation by down-regulating MAPKs pathways in vivo〔J〕.Neurol Res，2015；37(10)：859-66.

12Vossel KA，Xu JC，Fomenko V，etal.Tau reduction prevents Aβ-induced axonal transport deficits by blocking activation of GSK3β〔J〕.J Cell Biol，2015；209(3)：419-33.

13費洪新，高音，孫麗慧，等.黃芪多糖對阿爾茨海默病小鼠海馬組織的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(16)：4426-9.

〔2015-09-24修回〕

(編輯郭菁)

Effects of sulforaphane on ultrastructure and IL-1β of hippocampal in Alzheimer's disease rat

MENG Xin-Yu，WANG Shao-Dong，ZHAO Yao-Jie，etal.

Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040,Heilongjiang,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of sulforaphane(SFN)on ultrastructure and IL-1β of hippocampal in Alzheimer's disease(AD)rat.MethodsWistar rats were randomly divided into control，model，treatment(Piracetam 430 mg/kg)，SFN high-dose(40 mg/kg)，middle-dose(20 mg/kg)，low-dose(10 mg/kg)groups.Aβ(1～42) was injected into the bilateral hippocampal of rat to induce AD models.The rats were killed after 35 days continuous treating.After the treatment,all animals were sacrificed，ultrastructure of hippocampal was observed，calculated the organ coefficients of splenic and thymus.Biochemical methods were used to test the content of IL-1β.ResultsCompared with that of model group，the brain maintain normal morphological structure of hippocampal in SFN high-dose and medial-dose groups was significantly increased，the organ coefficients of splenic and thymus significantly were increased(P<0.05)，the level of IL-1β of hippocampal tissue were significantly decreased(P<0.05).ConclusionsSFN could maintain normal morphological structure of hippocampal of AD rat，increase organ coefficients of splenic and thymus，decrease IL-1β responses in the hippocampal tissue.

【Key words】Sulforaphane；Alzheimer′s disease；Ultrastructure

〔中圖分類號〕R285

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1281-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.001

通訊作者：李寶龍(1973-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事腦老化、癡呆、痛風和肝纖維化研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81573135，81373777，81173599)；黑龍江省教育廳科學技術項目(12541763)；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(博導類，20132327110010)

1齊齊哈爾醫學院

第一作者：孟鑫雨(1989-)，男，在讀碩士，主要從事腦老化、癡呆、痛風和肝纖維化研究。