TLR4抑制劑Tak-242對慢性盆腔炎大鼠炎癥指標及病理形態學改變的影響

王春梅　康　燕　靳紫薇　魏順英　黃華民

(青海紅十字醫院婦二科,青海　西寧　810001)

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TLR4抑制劑Tak-242對慢性盆腔炎大鼠炎癥指標及病理形態學改變的影響

王春梅康燕靳紫薇魏順英黃華民

(青海紅十字醫院婦二科,青海西寧810001)

〔摘要〕目的探討Toll樣受體(TLR)4抑制劑Tak-242對慢性盆腔炎大鼠炎癥指標及病理形態學改變的影響。方法采用向60只SD大鼠子宮注射苯酚膠漿的方法制備慢性盆腔炎模型，隨機分為4組(每組15只)：模型組、Tak-242低劑量組、Tak-242中劑量組和Tak-242高劑量組；Tak-242低、中、高劑量組則在造模后第8天開始腹腔注射0.1、0.3和1 mg/kg Tak-242，隔日1次，連續4 w；模型組則注射等體積生理鹽水。另選取15只同周齡SD大鼠作正常對照(對照組)。待治療結束后檢測各組大鼠血清炎癥因子〔腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-1β和高敏c-反應蛋白(hs-CRP)〕、免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)水平和免疫細胞功能(T細胞百分率、淋轉率和脾細胞NK活性)，取出子宮后進行病理形態學觀察。 結果與對照組相比，模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β、hs-CRP及子宮病理評分均升高，IgG、IgA、T細胞百分率、淋轉率及NK細胞活性均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；Tak-242腹腔注射治療后可改善上述指標，Tak-242中、高劑量組的上述指標均優于模型組(P<0.05)，且高劑量組的上述指標水平均優于低、中劑量組(P<0.05)。結論Tak-242可抑制慢性盆腔炎大鼠的炎癥反應，改善免疫功能及子宮病理改變，抑制TLR4通路可能成為慢性盆腔炎治療的新策略。

〔關鍵詞〕Toll樣受體4；Tak-242；慢性盆腔炎；炎癥指標；病理形態

隨著宮腔鏡操作普及、人工流產次數增多及性傳播疾病的泛濫，慢性盆腔炎的發病率上升且趨于年輕化〔1〕。目前對于慢性盆腔炎尚無特效療法，反復治療及過多抗生素使用可導致盆腔免疫功能紊亂，有效控制炎癥反應及繼發性炎癥性病理損害是治療該病的關鍵〔2〕。Toll樣受體(TLR)4)信號通路被認為是炎癥的重要信號因子，可識別受損細胞釋放的內源性配體，進而引發一系列的炎癥反應〔3〕。多項研究表明，多種抗炎藥可通過抑制TLR4通路發揮抗炎效果〔4,5〕，但抑制TLR4通路能否改善慢性盆腔炎的炎癥反應及炎癥性病理損害，國內外尚無相應文獻報道。本研究采用TLR4抑制劑Tak-242治療慢性盆腔炎大鼠模型，觀察對其炎癥反應及子宮病理形態學的影響。

1材料與方法

1.1儀器與試劑腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-1β和高敏c-反應蛋白(hs-CRP)酶聯免疫檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)檢測試劑購自上海科華公司，MK3型酶標儀為Thermo公司產品，7600-110型全自動生化分析儀為日本日立公司產品，FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2動物與分組取60只SPF級SD大鼠(體重200~220 g，購自北京維通利華公司)制備慢性盆腔炎模型，隨機分為4組(每組15只)：模型組、Tak-242低劑量組、Tak-242中劑量組和Tak-242高劑量組。同時選取15只同周齡的SD大鼠作正常對照(對照組)。Tak-242低、中、高劑量組在造模后第8天開始腹腔注射0.1、0.3和1 mg/kg Tak-242，隔日1次，連續4 w；模型組注射等體積的生理鹽水。所有大鼠的飼養環境及飼料相同，每籠按5只飼養，室內晝夜溫度(23±2)℃，濕度60%~70%，12 h/12 h明暗周期。

1.3慢性盆腔炎模型制備在飼養1 w后進行造模，禁食、禁水8 h后，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射，充分麻醉后取仰臥位，將大鼠四肢固定在操作臺上，作長約1 cm的腹部正中切口，開腹后將雙側子宮暴露并固定，選用4號針頭于子宮分叉處進入宮腔內，朝卵巢方向緩慢推注0.1 ml苯酚膠漿，造模完成后關閉腹腔，術區消毒。對照組僅行開腹手術及子宮暴露，不行腹腔注射。所有手術操作均嚴格遵循無菌操作原則。

1.4炎癥因子水平檢測采用酶聯免疫吸附法。末次給藥后禁食12 h，次日腹主動脈取血5 ml，以3 000 r/min(離心半徑為10 cm)離心10 min后，收集上清后采用TNF-α、IL-6、IL-1β和hs-CRP試劑盒檢測，操作均嚴格遵循試劑盒說明書。

1.5免疫球蛋白水平及免疫細胞功能檢測采用免疫濁度法檢測血清IgG、IgA和IgM水平，酸性非特異性酯酶染色法檢測T細胞百分率，體外植物血凝素(PHA)刺激的形態學法檢測淋轉率，流式細胞術檢測鼠脾NK細胞殺傷YAC細胞活性。

1.6病理形態學觀察待大鼠處死后，打開腹腔觀察腹腔積液及子宮情況，記錄子宮色澤、形狀、彈性、有無炎性包塊及與周圍組織有無粘連，游離子宮后將其切除，置于10%中性甲醛溶液中固定，常規HE染色后進行觀察。采用四分類法進行病理評分：按照由輕至重將子宮粘連或擴張、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內膜充血水腫及上皮細胞增生賦值為0~3分。病理形態評分由兩位病理科醫師采用雙盲法完成。

2結果

2.1各組大鼠的血清炎癥因子水平比較與對照組相比，模型組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β和hs-CRP水平均降低(P<0.05)；Tak-242低、中和高劑量組的上述4個炎癥因子水平均低于模型組，且高劑量組的炎癥因子水平均優于低、中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠的血清炎癥因子及免疫球蛋白水平比較±s,n=15)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與Tak-242低劑量組比較：3)P<0.05；與Tak-242中劑量組比較：4)P<0.05；下表同

2.2各組大鼠的血清免疫球蛋白水平比較與對照組相比，模型組的血清IgG和IgA水平均降低(P<0.05)；Tak-242中、高劑量組的血清IgG和IgA水平均高于模型組，且高劑量組的炎癥因子水平均優于低、中劑量組(P<0.05)；各組血清IgM水平的差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠的免疫細胞功能比較與對照組相比，模型組的T細胞百分率、淋轉率和NK細胞活性均降低(P<0.05)；Tak-242中、高劑量組的上述指標水平均高于模型組，且高劑量組的T細胞百分率、淋轉率和NK細胞活性均優于低、中劑量組(P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠的子宮病理改變評分比較與對照組相比，模型組的粘連或擴張、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內膜充血水腫及上皮細胞增生的病理評分均升高(P<0.05)；Tak-242低、中、高劑量組的上述病理評分均低于模型組，且高劑量組的上述病理評分均優于低、中劑量組(P<0.05)。見表3。

表2　各組大鼠的免疫細胞功能比較±s,n=15)

表3　各組大鼠的子宮病理改變評分比較±s,n=15)

3討論

慢性盆腔炎是由盆腔炎癥性疾病演變而來，由炎癥因子相互作用和局部免疫共同調節，慢性盆腔炎患者的免疫系統遭到破壞，對致病微生物的抵抗減弱，易受厭氧菌和需氧菌的混合感染，導致了炎性細胞浸潤，進一步影響盆腔及宮旁結締組織〔6〕。目前抗生素是治療該病的主要措施，但效果欠佳，長期使用會引發菌群紊亂，最終導致耐藥的發生，故從根本上抑制炎癥反應是該病的治療重點〔7〕。TLR4通路在介導炎癥反應中的關鍵作用已被證實，目前多種抑制TLR4通路的措施均獲得較好的抗炎效果〔5,8〕，如TLR4抑制劑Tak-242對腦急性缺血再灌注損傷伴有的炎癥反應有保護作用。Lin等〔8〕發現Tak-242可抑制脂多糖刺激誘發的滑膜成纖維細胞中 IL-1β和TNF-α 合成和釋放。鑒于慢性盆腔炎是一種炎性反應，且抑制TLR4通路對于炎癥反應有較好緩解效果，本研究推測TLR4抑制劑Tak-242對慢性盆腔炎可能有較好治療效果。

參與機體免疫系統的炎癥因子較多，主要包括輔助性T1細胞分泌的促炎因子和輔助性T2細胞分泌的抑炎因子，且兩類因子的平衡對于維持正常免疫功能有重要意義，當兩者失衡時可導致疾病的發生〔9〕。TNF-α、IL-6和IL-1β是促炎因子，在炎癥初期有助于機體免疫的抗感染作用，但其持續升高會導致一系列病理生理改變，如誘導內皮細胞產生黏附分子、引起局部炎癥反應及對子宮組織造成病理性損傷〔10〕。hs-CRP是參與炎癥反應的急性時相蛋白之一，為評價炎癥反應的靈敏指標〔11〕。本研究發現抑制TLR4可有效緩解慢性盆腔炎的炎癥反應，與本研究之前的推測一致。

慢性盆腔炎患者的免疫力低下，導致了破壞性過度炎癥反應，故理想的治療措施不僅可緩解炎癥反應，而且可提高機體的免疫功能〔12〕。本結果表明抑制TLR4可有效改善其免疫功能。子宮病理性改變是慢性盆腔炎的常見表現〔6〕，對子宮病理形態是否有改善作用也是評價治療有效的重要指標。本研究進一步觀察抑制TLR4對子宮病理形態的影響發現，給予Tak-242治療后，粘連或擴張、上皮變性壞死、慢性炎癥浸潤、內膜充血水腫及上皮細胞增生的病理評分均獲大幅改善，表明抑制TLR4通路對慢性盆腔炎治療的有效性。

綜上所述，Tak-242可抑制慢性盆腔炎大鼠的炎癥反應，改善免疫功能及子宮病理改變。故抑制TLR4通路可能成為慢性盆腔炎治療的新策略。

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〔2015-07-19修回〕

(編輯徐杰)

〔中圖分類號〕R711.33

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1053-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.013

第一作者：王春梅(1980-)，女，主治醫師，主要從事盆底功能、婦科腫瘤研究。