高糖因素在人腎小球內皮細胞補體凝集素途徑激活機制的作用

樊文星　肖　樺　楊秋萍　黃　潔　黃頌敏

(昆明醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，云南　昆明　650032)

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高糖因素在人腎小球內皮細胞補體凝集素途徑激活機制的作用

樊文星肖樺楊秋萍1黃潔黃頌敏2

(昆明醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，云南昆明650032)

〔摘要〕目的觀察高濃度葡萄糖對人腎小球內皮細胞(HRGEC)表面補體凝集素途徑(LCP)相關信號通路蛋白表達的影響。方法將HRGEC分3組：高糖組、正常糖組和甘露醇組，分析HRGEC細胞表面甘露聚糖結合凝集素(MBL)、C3及C5b-9沉積的變化。結果HRGEC表面MBL和C3沉積隨糖作用時間的延長而增加，72 h達峰值(P<0.05)，隨糖濃度的升高而增加，60 mmol/L達峰值(P<0.05)；高糖組HRGEC表面MBL、C3及C5b-9沉積均明顯高于正常糖組和甘露醇組(P<0.05)。結論葡萄糖可隨時間及濃度依賴性促進HRGEC表面MBL和C3沉積；高濃度葡萄糖刺激可能氧化應激誘導HRGEC表面糖基化發生改變，激活LCP途徑，引發HRGEC表面C5b-9沉積的增加。

〔關鍵詞〕高糖；人腎小球內皮細胞；補體凝集素途徑；激活

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的重要微血管并發癥之一，也是慢性腎衰竭的主要原因。高血糖是DN發病的主要環境因素，高血糖可引起多元醇代謝通路激活、蛋白質非酶糖基化、蛋白激酶C過度活化，促進DN發生發展。DN發病過程中，腎小球內皮細胞位于血液與組織接觸處，最先接觸血液中的各種致病因子，為各種病理生理因素作用的自然靶細胞。當DM血糖異常持續升高而引發細胞功能紊亂時，內皮細胞便成為首當其沖的受害者〔1，2〕。本文擬采用人腎小球內皮細胞(HRGEC)，體外模擬高糖狀態下補體凝集素途徑(LCP)激活，設置不同的糖濃度和作用時間，觀察HRGEC表面甘露聚糖結合凝集素(MBL)、C3及補體攻膜復合體(MAC)沉積的變化，探討高糖因素在HRGEC的LCP激活機制中的作用。

1材料與方法

1.1試劑及儀器HRGECs、內皮細胞培養基(ECM)、胎牛血清(FBS)和內皮細胞生長因子(ECGF)購自ScienCell公司；甘露聚糖、Sepharose 4B、胰蛋白酶和抗人vWF抗體購自Sigma公司；小鼠抗人MBL單克隆抗體購自Hycult Biotechnology公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記小鼠抗人C3單克隆抗體購自LifeSpan公司；鏈霉親和素-PE/Cy5購自Biolegend公司；小鼠抗人C5b-9單克隆抗體購自Santa Cruz公司；重組人MBL購自R&D公司。EPICS-XL型流式細胞儀：Beckman-Coulter公司；倒置顯微鏡：Olympus CK40；正置熒光顯微鏡：Olympus BX51；水平電泳儀：BIO-RAD公司；Gel Doc 1000凝膠成像系統：BIO-RAD公司。

1.2細胞培養將HRGEC加入ECM培養基培養，待細胞達80%融合，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細胞5 min，加含5%胎牛血清的ECM培養基4 ml終止消化，收集細胞懸液，離心，接種于已裝有ECM培養基的培養瓶，接種密度5×104個/ml，放入培養箱中繼續培養，取第6代HRGEC。

1.3高濃度葡萄糖作用時間對細胞LCP通路激活的影響HRGEC予以30 mmol/L葡萄糖ECM培養基，分別作用0、12、24、48和72 h，更換培養液，加入30%MBL-Def HS+外源性MBL 1 μg/ml，作用4 h。

1.4不同葡萄糖濃度對細胞LCP通路激活的影響HRGEC分別給予0、15、30和60 mmol/L的葡萄糖ECM培養基刺激72 h，更換培養液，其余操作同1.3。

1.5不同干預條件對細胞LCP通路激活的影響高糖組：葡萄糖30 mmol/L的ECM培養基刺激72 h，更換培養液，其余操作同1.3；正常糖組：葡萄糖5 mmol/L+甘露醇25 mmol/L ECM培養基刺激72 h，其余操作同高糖組；甘露醇組：甘露醇30 mmol/L ECM培養基刺激72 h，其余干預條件同于高糖組。

1.6指標檢測采用流式細胞術和免疫熒光檢測HRGEC細胞表面MBL、C3及C5b-9沉積的變化。

1.7統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1高濃度葡萄糖作用時間對HRGEC表面MBL和C3沉積的影響HRGEC表面MBL和C3沉積隨30 mmol/L葡萄糖的作用時間的延長而呈現遞增趨勢(P<0.05)，72 h達高峰，見表1。

表1　高濃度葡萄糖作用時間對HRGEC表面MBL和

與0 h比較：1)P<0.05

2.2不同葡萄糖濃度對HRGEC表面MBL和C3沉積的影響HRGEC表面MBL和C3沉積隨體外葡萄糖濃度升高而遞增(P<0.05)，60 mmol/L達峰值，見表2。

2.3不同干預條件對HRGEC表面MBL和C3沉積的影響與正常糖及甘露醇組比，高糖組HRGEC表面MBL和C3沉積明顯增高(P<0.05)，見表3。

表2　不同葡萄糖濃度對HRGEC表面MBL和

與0 mmol/L組比較：1)P<0.05

表3　不同體外干預條件對HRGEC表面MBL和

與正常糖組比較：1)P<0.05；與甘露醇組比較：2)P<0.05

2.4不同干預條件對HRGEC表面C5b-9沉積熒光強度的影響高糖組C5b-9(20.93±1.25),與正常糖組(0.93±0.15)及甘露醇組(0.87±0.15)比，沉積熒光強度明顯增高，見圖1。

圖1　不同干預條件對HRGEC表面C5b-9沉積熒光強度的影響(×400)

3討論

MBL是肝細胞分泌的血清糖蛋白，屬于C型凝集素超家族中膠凝素家族成員，是天然免疫系統的模式識別分子。成熟MBL肽鏈自N端至C端依次分為：富含Cys的N端區、膠原樣區(CLR)、頸區和C端糖識別區(CRD)。CRD是MBL分子識別功能區，可選擇性識別多種病原體表面的糖結構；CLR是MBL分子效應功能區，MBL可通過此區與MBL相關絲氨酸蛋白酶(MASPs)結合形成復合物，該復合物可激活MASPs酶原，活化的MASPs酶原可激活與CLR相結合的MASPs(如MASP-2和MASP-1)，活化的MASP-2和MASP-1可間接或直接裂解C3，形成C5轉化酶，激活LCP，形成末端效應產物C5b-9沉積于細胞表面。因此通過考察MBL(啟動因子)、C3(中心環節)和C5b-9(末端效應產物)表達可以驗證LCP激活過程〔3~6〕。

本文結果提示葡萄糖刺激時間和刺激濃度均可顯著影響細胞表面LCP激活。HRGEC表面“MBL+C3共表達”及C5b-9沉積可代表著整個LCP激活的過程，本文結果表明高濃度的葡萄糖可促進人腎小球內皮細胞整個LCP激活過程，這種促進作用可能與滲透壓無關。

高血糖引發的過氧化產物對血管內皮細胞損傷是DM慢性并發癥機制中關鍵性的第一步。體內外研究均發現：高血糖能夠直接引發DM患者和正常受試者的血管內皮損傷及內皮依賴性舒張反應減弱〔7，8〕，此效應是由自由基介導的，能夠被抗氧化劑所逆轉〔9，10〕。細胞缺氧和氧自由基的形成可能使細胞表面某些基團發生糖基化改變，導致細胞表面MBL沉積增加和LCP激活〔11~13〕。內皮細胞位于血液與組織接觸處，這使它成為自身內皮細胞或者炎癥反應中的粒細胞產生的氧化劑的一種潛在靶目標〔13〕。Collard等〔11〕研究發現內皮氧化應激可能通過改變細胞膜表面的糖基化作用而引起LCP激活，導致內皮細胞表面MBL和C3沉積均明顯增加。根據上述結果，推測高糖導致的氧化應激可能誘導HRGEC表面某些基團發生糖基化改變，發生糖基化改變的基團被MBL分子的CRD選擇性識別和結合，從而激活MASPs酶原，使通過CLR與MBL分子相結合的MASPs活化，進而導致整個LCP途徑激活。

綜上，葡萄糖可時間及濃度依賴性促進HRGEC表面MBL和C3沉積；高濃度葡萄糖刺激可能氧化應激誘導HRGEC表面糖基化發生改變，激活LCP途徑，引發HRGEC表面C5b-9沉積的增加。

4參考文獻

1Khan Mohammed A，Medarametla C，Rabbani MM，etal.Role of a clinical pharmacist in managing diabetic nephropathy：an approach of pharmaceutical care plan〔J〕.J Diabet Metab Disord，2015；4(10)：82-6.

2Tabrez S，Al-Shali KZ，Ahmad S.Lycopene powers the inhibition of glycation-induced diabetic nephropathy：a novel approach to halt the AGE-RAGE axis menace〔J〕.Biofactors，2015；41(5)：372-81.

3Jenny L，Ajjan R，King R，etal.Plasma levels of mannan-binding lectin-associated serine proteases MASP-1 and MASP-2 are elevated in type 1 diabetes and correlate with glycaemic control〔J〕.Clin Exp Immunol，2015；180(2)：227-32.

4Xing GQ，Chen M，Liu G，etal.Differential deposition of C4d and MBL in glomeruli of patients with ANCA-negative pauci-immune crescentic glomerulonephritis〔J〕.J Clin Immunol，2010；30(1)：144-56.

5Beltrame MH，Boldt AB，Catarino SJ，etal.MBL-associated serine proteases(MASPs)and infectious diseases〔J〕.Mol Immunol，2015；67(1)：85-100.

6Keizer MP，Pouw RB，Kamp AM，etal.TFPI inhibits lectin pathway of complement activation by direct interaction with MASP-2〔J〕.Eur J Immunol，2015；45(2)：544-50.

7Perez Gutierrez RM，de Jesus Martinez Ortiz M.Beneficial effect of Azadirachta indica on advanced glycation end-product in streptozotocin-diabetic rat〔J〕.Pharm Biol，2014；52(11)：1435-44.

8Lankin V，Konovalova G，Tikhaze A，etal.The initiation of free radical peroxidation of low-density lipoproteins by glucose and its metabolite methylglyoxal：a common molecular mechanism of vascular wall injure in atherosclerosis and diabetes〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；395(1-2)：241-52.

9Babizhayev MA.Patenting strategies，the authentication US fiscal methodology，discovery and development of imidazole-containing peptide compounds with free-radical scavenging and transglycating properties acting as targeted drug regulators and homeostatic agents with diverse therapeutic activities for pharmacy of diabetes and metabolic diseases〔J〕.Expert Opin Ther Pat，2015；25(11)：1-21.

10Moinuddin Ansari NA，Shahab U，Habeeb S,etal.Immuno-chemistry of hydroxyl radical modified GAD-65：a possible role in experimental and human diabetes mellitus〔J〕.IUBMB Life，2015；67(10)：746-56.

11Collard CD，Lekowski R，Jordan JE，etal.Complement activation following oxidative stress〔J〕.Mol Immunol，1999；36(13-14)：941-8.

12Rosbjerg A，Munthe-Fog L，Garred P，etal.Heterocomplex formation between MBL/ficolin/CL-11-associated serine protease-1 and-3 and MBL/ficolin/CL-11-associated protein-1〔J〕.J Immunol，2014；192(9)：4352-60.

13Skjoedt MO，Hummelshoj T，Palarasah Y，etal.Serum concentration and interaction properties of MBL/ficolin associated protein-1〔J〕.Immunobiology，2011；216(5)：625-32.

〔2014-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

《中國老年學雜志》被國際數家數據庫、檢索性期刊檢索機構收錄情況

根據國際檢索機構給中國科學技術期刊編輯學會國際交流工作委員會、中國高等學校自然科學學報研究會對外聯絡委員會發來的電子郵件及其附件統計整理, 《中國老年學雜志》2009年又被4種國際重要檢索系統列為來源期刊:

1)美國化學文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科學技術社(中國文獻數據庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美國《烏利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/；

5)美國《劍橋科學文摘：生物科學》(CSA：BS)。

〔中圖分類號〕R692.6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1035-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.005

基金項目：2013年度云南省教育廳科學研究基金項目(No.2013Y289)

1昆明醫科大學第一附屬醫院干療科2四川大學華西醫院腎臟內科

第一作者：樊文星(1981-)，男，醫學博士，講師，主治醫師，主要從事腎臟病研究。